聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。

凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。

不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示：
表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b
3.51000－2000 460 100
5.080－500 260 65
8.060－400 160 45
12.040－200 70 20
15.025－150 60 15
20.0 6－100 45 12
a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30
b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。

聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。

聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。

在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。

聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。

聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。

常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶：
（1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶
（2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原理】
非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA片段（<1 000bp），多数双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而使迁移率
相差10％，故不能用它来确定双链DNA 的大小。

【试剂及配置】
1. 30％丙烯酰胺：丙烯酰胺29g ，N ，N'-甲叉双丙烯酰胺1g ，加水到100ml ，加热至37℃溶解，室温避光保存，存贮期间溶液pH 值应≤7.0。

2. 5×TBE 缓冲液（pH8.3）:54 Tris 碱，27.5硼酸，20ml 0.5mol/L
EDTA(pH8.0),加水至1L 。

3. 10％过硫酸铵（AP ）：AP 1g 加水定容到10ml ，4℃下可存贮数周。

4. TEMED （N ˊ,N ˊ,N ˊN ˊ-四甲基乙二胺）。

5. DNA 分子量标准。

6. 6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF,30％甘油溶于水中。

7. 溴化乙锭（EB ）1mg/ml 或银盐染色法所需试剂。

【操作步骤】
1.用洗涤剂浸泡玻璃板，填条和样品梳，必要时用KOH/甲醇清洗（100ml 甲醇加5gKOH 配置），水洗后再用乙醇淋洗。

每块玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液处理，以防凝胶与玻片贴紧并减少卸胶时凝胶破裂的可能性。

2.装好灌胶用的玻璃片及垫条，用琼脂糖封住底、左、右三边。

（进口Bio －Rad 垂直板电泳设备可不用封胶）
3.依所分离DNA 的大小来确定合适的凝胶浓度，如表所示
表2 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积
制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的体积 3.5 5.0 8.0 12.0 20.0
30％丙稀酰胺 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH 2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5×TBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 10％过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
4.每100ml 胶液中加入35μlTEMED ，迅速混匀，用注射器注入胶床，插入
样品梳，应密切注意胶内不要有气泡，检查有无凝胶渗漏。

5.室温下聚合约30min ，聚合完全时可见梳齿下二条折光线，小心拔出样品梳。

6.在电泳槽中加入1×TBE 缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔，并用缓冲液冲洗样品孔。

7.于DNA 样品加1/5体积6×凝胶上样缓冲液混合，小心注入样品孔中（加样量为3～5μl ）。

8.接上电极，以5V/cm （1～8V/cm ）的电压进行电泳。

9.参照染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶。

按下列方法之一进行染色或显影，检测DNA 的位置：
（1）溴化乙锭染色法：由于PAG 能抑制EB 的荧光量，故用该法时，DNA 量需大于10ng 。

将凝胶和玻璃板一起放入含0.5μg/mlEB 的1×TBE
缓冲液中，
30～45min后取出，水洗，紫外检测仪观察并照相。

（2）银盐染色法：
①10％乙醇固定3min；
②双蒸水洗1min；
③2%HNO3洗3min；
④双蒸水洗1min；
⑤0.18％AgNO3轻摇20min；
⑥双蒸水洗1min；
⑦3%Na2CO3显影30min（临用前配置，每100ml加入10μl甲醛）。

【问题与讨论】
●如何判断丙烯酰胺是否已聚合？
丙烯酰胺聚合后梳子下方可以看见折光率不同的纹线。

●“微笑”DNA是怎样造成的？
①凝胶太厚导致电泳时产生的热量很大，DNA条带出现微笑样弯曲
②电泳时电压太高，凝胶中部产热不同而致DNA条带弯曲
●为什么有时候DNA条带成波浪形弯曲或严重扭曲？
①在拔出梳子后没有立即彻底冲洗加样孔，梳子残留的少量丙烯酰胺溶液
在加样孔中聚合产生不规则的表面，引起DNA条带变形。

②在电泳槽和凝胶中使用的不是同一批次的电泳缓冲液，离子强度或PH值
的微小差异会形成缓冲液前沿，使DNA片断的迁移发生严重扭曲
●在银染中背景太深是如何造成的？
甲醛加的太多或是Na2CO3配置的时间过久已发生了变化。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原理】
变性聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在的情况下聚合而成的，用于分离和纯化单链DNA（RNA）片段，核酸的迁移率和碱基的组成及序列无关，常用于：①测定双链DNA的长度；②回收寡核苷酸。

此方法迅速、简单、分辩率高，虽然产量较低（<50％所加样品），但也足以满足大部分工作的需要。

多用于分离同位素标记的探针、分析SI核酸酶的产物和DNA测序等。

【试剂及配制】：
1.5×TBE缓冲液（pH8.3）:54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),
加水至1L。

2.42％丙稀酰胺：丙稀酰胺40g，N,Nˊ-甲叉双丙稀酰胺2g，加ddH2O至100ml，
加热至37℃溶解，室温避光保存。

3.TEMED(Nˊ,Nˊ,NˊNˊ-四甲基乙二胺)。

4.尿素。

5.10%过硫酸铵（AP）。

6.2×甲酰胺上样缓冲液：
5×TBE 0.2ml
去离子甲酰胺 0.9ml
10%溴酚蓝 50μl
7.7.0.3mol/L乙酸钠（pH7.5）。

8.8.TE缓冲液（10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0）。

【操作步骤】
1.制备PAG-尿素凝胶，按寡核苷酸长度权择适当浓度的凝胶（12%，15%，19%的
尿素PAG分别对应被分离合适的寡核苷酸长度40～100,25～40，<25mer）。

按下列混合：称取25.2尿素（终浓度7mol/L）,取12ml 5×TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10%AP200μlTEMED30μl，混合并倒胶（避免气泡产生），在室温下聚合30min以上。

2.取出样品梳，安装电泳装置，在电泳槽中入1×TBE，1500V电压预电泳15～
30min。

3.用等体积的2×甲酰胺上样缓冲液稀释样品（上样前可在90℃加热3min以消除
二级结构的干扰），产生清晰的带需要10μg寡核苷酸。

4.用TBE冲洗上样孔数次，洗净尿素，上样。

5.1500V电压进行电泳，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时，停止电泳。

6.卸下玻璃板，取出凝胶块，染色或显影，检测DNA的位置。