研究生课 泛素化介导的蛋白质降解 含NCB和NM文章 分子生物学课
中科院攻读硕士学位研究生入学试题《生物化学及分子生物学》
中科院20XX年攻读硕士学位研究生入学试题《生物化学及分子生物学》生物类考研专业课资料一、判断题 20题，20题，每题1.5分，共30分.1、鞘磷脂的代谢过程主要与细胞质膜的流动有关与细胞生物活性分子的生成调节无关。
2、蛋白质的修饰与其运输和定位有关，而与其降解代谢无关。
3、蛋白质的豆蔻酰化是蛋白质脂肪酸化的一种形式。
4、可逆性膜锚定与蛋白激酶参与的信号转到有关，而与G蛋白（如Ras）参与的信号转导无关。
5、蛋白质溶液出现沉淀与蛋白质变性存在必然的关系。
6、Km值是酶的特性常数之一，与酶的浓度、pH、离子强度等条件或因素无关。
7、一个酶的非竞争性抑制剂不可能与底物结合在同一部位。
8、蛋白质泛素化（ubiquitination）过程需要三种蛋白质（酶）的参与，其中之一是泛素--蛋白连接酶。
9、往线粒体悬液中加入NADH可以还原线粒体的辅酶Q。
10、膜上有些七次跨膜受体在与配基结合时会形成二体。
11、低浓度不含钾离子的等渗缓冲液中悬浮着内含0.154M氯化钾的脂质体，此时往悬浮液中加入缬氨霉素，悬浮液的pH会下降。
12、内质网系膜结合的钙ATP酶在催化ATP水解时促进Ca2+/2H+交换。
13、辅酶I（NAD+ ）、辅酶II（NADP+）、辅酶A（CoA）、黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）中都含有腺嘌呤（AMP）残基。
14、端粒酶（telomerase）是一种RNA蛋白质复合物，其作用机制是以RNA为模板，由蛋白质催化逆转录; 所以广义上说，端粒酶是种逆转录酶。
15、Tm是DNA的一个重要特性，其定义为：使DNA双螺旋90％解开时所需的温度。
16、与DNA双螺旋相反方向缠绕而形成的超螺旋叫做“负超螺旋”。
17、细菌中的插入序列（IS）具有转座能力，能随机插入到任一DNA序列中，在靶点两侧形成一段短的正向重复序列。
18、细菌代谢酶的诱导和合成途径中酶的阻遏，调节蛋白都对操纵子起负调控作用。
泛素调节蛋白质降解途径
意义
了解了泛素为媒介的蛋白质裂解作用和 过程，使得科学家对细胞如何控制及分裂蛋 白质的研究有可能深入到分子层级。而当蛋 白质裂解作用发生异常时，人体就会产生不 适甚至疾病，如子宫颈癌症和囊肿纤维症等， 因此，从分子层面角度去了解泛素调节的蛋 白质降解的化学过程和机理，及对生命过程 进一步的探索，具有十分重要的应用意义。
第二阶段: 靶蛋白在26 s蛋白酶体的作用下,由泛素介导的蛋白水解过程。 经泛素活化的底物蛋白被展平后,通过两个狭孔,进入26 s蛋白酶体的催化 中心,蛋白降解在20 s蛋白酶体内部发生。进入26 s蛋白酶体的底物蛋白质 被多次切割,最后形成3～22个氨基酸残基的小肽。 整个流程分为以下六个步骤： 1、E1类酶激活泛素，该过程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量； 2、泛素转移至E2类酶； 3、E3类酶具有特异性，可以识别出需破坏的目标蛋白质，与目标蛋白质 接近的E2-泛素复合体将泛素转移至目标蛋白质； 4、E3类酶释放出被泛素标记的蛋白质； 5、被标记的蛋白质分子尾端形成一小段泛素分子链； 6、泛素分子链在蛋白酶体的端口被识别并脱离蛋白质，目标蛋白质进入 蛋白酶复合体的桶状通道最终降解为缩氨酸并由另一端口释放出去。
泛素—蛋白酶体途径( upp ) 一系列相关的酶
泛素活化酶(E1)是催化泛素与底物结合所需的第一个酶。 细胞内仅有单一的泛素活化酶基因。利用不同的转录起始点, 它可产生E1a 和E1b两种泛素活化酶,它们的生物功能可能有所 不同。 泛素偶连酶(E2)是泛素与蛋白底物结合所需的第二个酶。 细胞内有多种泛素偶连酶基因,大多数泛素偶连酶有一个14～ 16 KD的核心,含有活性所必需的半胱氨酸残基。在不同的泛素 偶连酶间有约35%的同源性,这一区域可能参与泛素偶连酶和蛋 白底物的结合。 泛素-蛋白连接酶是泛素与底物蛋白结合所需的第三个酶。 泛素-蛋白连接酶在决定泛素介导的底物降解方面有特殊的作 用。不同类型的泛素-蛋白连接酶间缺乏序列同源性,而且分子 量差异较大。
王镜岩生化真题名词解释整理汇总情况
王镜岩——生物化学名词解释（2013年~2002年）【2013年】1.寡聚蛋白质（oligomeric protein）：两条或两条以上具有三级结构的多肽链组成的蛋白质。
（也称多聚蛋白质）。
如：血红蛋白（两条α链，两条β链）、己糖激酶（4条α链）。
附：仅由一条多肽链构成的蛋白质称为单体蛋白质。
如：溶菌酶和肌红蛋白【第三章蛋白质】（上159）2.酶的转换数(turnover number,TN)：即K3，又称催化常数（catalytic constant,K cat）是指在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。
（通常来表示酶的催化效率）附：[ 或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数] ，大多数酶对它们的天然底物的转换数的变化围是每秒1到104（上321）【第四章酶】3.糖的变旋现象（mutarotation）：是当一种旋光异构体，如糖溶于水中转变为几种不同的旋光异构体的平衡混合物时，发生的旋光变化的现象。
【第一章糖类】（上8；2013、2008）4.油脂的酸值（acid number）：是指中和1g油脂中的游离脂肪酸所消耗KOH 的毫克数。
【第二章脂类和生物膜】（上95）5.激素受体：位于细胞表面或细胞，结合特异激素并引发细胞响应的蛋白质。
【第六章维生素、激素和抗生素】6.乙醛酸循环（glyoxylic acid cycle ,GAC）：是一种被修改的三羧酸循环，在两种循环中具有某些相同的酶和产物，但代谢途径不同，在乙醛酸循环中乙酰CoA首先和草酰乙酸缩合成柠檬酸，然后转变为异柠檬酸，再裂解为琥珀酸和乙醛酸，在这一循环中产生乙醛酸，故称乙醛酸循环。
【第八章糖代谢】（这个循环除两步由异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶催化的反应外，其他的反应都和“柠檬酸循环”相同。
）（2013、2012）资料2：又称三羧酸循环支路，该途径在动物体不存在，只存在于植物和微生物中，主要在乙醛酸循环体中和线粒体中进行。
乙醛酸循环从草酰乙酸与乙酰CoA缩合形成柠檬酸开始，柠檬酸经异构化生成异柠檬酸，与TCA循环不同的是异柠檬酸经异柠檬酸裂解酶裂解为琥珀酸和乙醛酸。
医学分子生物学 蛋白质的修饰与降解
利用电泳、免疫共沉淀、色谱、生物质 谱、生物信息学等方法，对修饰蛋白质及 修饰位点进行鉴定。
第二节
蛋白质的降解
蛋白质的降解途径
• 泛素-蛋白酶体通路：需能，高效、特异的 蛋白质降解过程，控制着动植物体内绝大 多数蛋白质的降解。
• 自噬-溶酶体：不需能量。主要降解细胞外 和细胞膜蛋白质
泛素-蛋白酶体系统
溶酶体
蛋白质的修饰
概念：是指蛋白质翻译后进行共价修饰加工的过程， 通过一个或几个氨基酸残基加上修饰基团而改变 蛋白质的性质。
目的：调节蛋白质的活性，使蛋白质结构更为复杂， 功能更完善。
蛋白质的修饰
• 磷酸化修饰 • 脂基化修饰 • 甲基化修饰 • 乙酰化修饰 • 类泛素化修饰 • 巴豆酰化修饰
一、磷酸化修饰
泛素化过程的关键酶
• 泛素激活酶E1：细胞只表达一种E1，将泛素转 移到泛素结合酶E2上；
• 泛素偶连酶E2：约50种，E2与许多E3作用； • 泛素连接酶E3：约1000种，直接或间接与底物
蛋白结合，促进泛素从E2的硫酯键转移到底物 蛋白上，作为被UPS识别和降解的靶向信号。
泛素化反应
1. 泛素的活化：以ATP为能量，将泛素C-端的羧基 连接到泛素活化酶E1的巯基上，形成一个泛素和 泛素活化酶E1之间的硫酯键。
• 大多数蛋白质通过26S蛋白酶体以ATP和泛素依赖 方式降解；11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA20020S-19S以不依赖ATP和泛素的方式降解一些调节 蛋白、氧化蛋白及衰老蛋白。
泛素的结构与组成
• 泛素含有76个氨基酸残基, 广泛存在于真核生物， • 泛素的氨基酸序列极其保 守。 •泛 素 共 价 结 合 于 底 物 蛋 白 的赖氨酸残基上，将底物蛋 白进行泛素化标记而被UPS 特异识别并迅速降解。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(319)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。
答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。
②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要集中在水相中。
④将水相转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。
⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管底部观察到通过观察白色沉淀，即为RNA。
⑥用75温热的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。
⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。
（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，跑琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。
②吸光度检测：使用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他有机物的污染可以接受。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 肿瘤通常是抑癌基因和原癌基因两者都突变后才发生的（）。
答案：正确解析：恶性肿瘤的形成往往涉及多个数个基因的改变，与原癌基因、抑癌基因突变的逐渐积累有关。
肿瘤的发生归根到底是因为原癌基因的激活和抑癌基因的功能丧失，往往涉及多个基因的改变。
2. 叶绿体的rRNA核糖体是由16S、5S、23S、5.8S组成的。
（）答案：错误解析：叶绿体蛋白合成所有的核糖体的沉降系数为70S，由鞭叶的两个亚基（50S和30S）组成，和原核生物的核糖体十分相似。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(243)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。
A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。
要求表达的重组蛋白C端带His标签。
答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。
（2）His标签坐落于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的短片插入时的顺序不颠倒。
（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证互补肽键可以顺利结合。
上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。
下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 若双链DNA中的一条链碱基顺序为pCpTpGpGpApC，则另一条链的碱基顺序为pGpApCpCpTpG。
（）答案：错误解析：因为DNA单链书写时是5′端在前，而DNA双螺旋中的两条链是反向互补平行，因此若双链DNA中的一条链碱基分组为pCpTpGpGpApC，则另一条链的碱基顺序为pGpTpCpCpApG。
2. 尼龙膜是核酸杂交的一种固体支持物，具有同DNA结合能力强韧性强，可反复洗脱运用，并且杂交信号本底低。
（）答案：错误解析：尼龙莱菲县膜是核酸杂交的一种固体支持物，有同DNA结合能力强、韧性强，可反复洗脱使用，并且杂交信号本底低等优点，但是成本高。
一个新的蛋白质去泛素化酶的鉴定以及功能
05
总结与展望
研究结论
01
鉴定了一个新的蛋白质去泛素 化酶，并对其进行了初步的功 能研究。
02
发现该酶具有去泛素化活性， 能够恢复某些被泛素化的蛋白 质的功能。
03
揭示了该酶在细胞生长、凋亡 及肿瘤发生等生物学过程中的 作用。
研究不足与展望
仍需进一步研究该酶的具体作用机制和 调节方式。
需要明确该酶在人体中的生理和病理作用， 以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用价值 。
03
生物样本收集
收集肿瘤组织及其对应的 正常组织，用于后续实验 。
试剂与仪器
准备相关试剂和仪器，如 抗体、酶标仪等。
实验操作
进行蛋白质提取、免疫印 迹等实验操作。
实验结果与分析
蛋白质表达差异
01
比较肿瘤组织和正常组织中蛋白质的表达情况，发现某些蛋白
质在肿瘤组织中的表达水平有明显变化。
目标蛋白质筛选
研究目的和方法
• 本研究的目的在于鉴定一个新的蛋白质去泛素化酶，并对其 功能进行深入探究。首先，我们将通过生物信息学方法预测 和筛选可能的去泛素化酶；接着，我们将通过实验验证预测 结果，并进一步分析其底物特异性、活性调节机制以及在细 胞中的功能等。
02
蛋白质去泛素化酶的鉴定
实验材料与方法
01
02
03
蛋白质去泛素化酶的功能 研究
实验材料与方法
实验材料
选择本实验室已建立的蛋白质去泛素化酶基因敲除细胞系作 为研究对象，采用已有的蛋白质印迹、免疫共沉淀等方法进 行实验。
实验方法
通过基因敲除技术，构建蛋白质去泛素化酶基因敲除细胞系 ；采用蛋白质印迹法检测敲除前后的蛋白质去泛素化酶表达 情况；采用免疫共沉淀法检测敲除前后的蛋白质去泛素化酶 与目标蛋白的相互作用情况。
泛素化蛋白修饰
17
泛素连接酶Parkin的失活与帕金森氏症（AR-JP) 的失活与帕金森氏症（ 泛素连接酶 的失活与帕金森氏症
Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:384–389 18
Parkin Substrates
Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:384–389 19
泛素-C-末端水解酶 泛素 末端水解酶 ，通常参与蛋白降解后泛素分子的再 利用及对多聚泛素链的修饰， 利用及对多聚泛素链的修饰，也参与由泛素前体产生泛素 单体的过程（ UCH37、UCH-L1)。 单体的过程（如UCH37、UCH-L1)。 参与去除蛋白质上的多聚泛素链， 泛素特异性蛋白酶 ，参与去除蛋白质上的多聚泛素链，也 可从短泛素链的末端去掉单个泛素（ USP8)。 可从短泛素链的末端去掉单个泛素（如USP8)。
去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现90多种。 去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现90多种。 90多种
16
泛素化途径的异常与人类重大疾病
• 神经退行性疾病（如帕金森氏症）： 神经退行性疾病（ 帕金森氏症）： Parkin, UCH-L1 • 癌症 癌症: BRCA1, CYLD, Mdm2, Nrdp1, pVHL • 传染病病原体的入侵、致病机制 传染病病原体的入侵、致病机制: E6-AP
欧文.罗斯 欧文 罗斯
3
近年与泛素－蛋白酶体相关的 近年与泛素－蛋白酶体相关的PubMed论 论 文数在持续增长
篇数
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009
泛素—蛋白酶途径降解蛋白质与疾病
泛素结合酶
目前有 50 种泛素结合酶（ E2 ）被发现， 其中酵母中13 种，哺乳动物中有20 多种，由 此推测E2 的多样性与靶蛋白泛素化特异性有 关; 多数E2为小分子量蛋白，其共性是有14－ 16KD 核心区域，核心区域内含有维持其活性 所需的半胱氨酸残基；其主要功能是把泛素连 接到靶蛋白或E3上。
单泛素化
单泛素化是一个由多种酶（ E1 、 E2 、 E3 ）和ATP 参与的级联反应。与磷酸化相 似，泛素化是一个可逆的过程，通过泛素 化酶和去泛素化酶维持平衡。单泛素化不 能降解靶基因，只是起到调节作用。泛素 化过程如下图所示。
图1 泛素化的过程
多聚泛素化
多聚泛素化，即由数个泛素分子形成的泛素链 C端的甘氨酸与单泛素化底物特异性结合。Ub 与 靶蛋白的共价连接，至少需要4 － 5 个Ub 连接到 靶蛋白上，形成多聚泛素链。
2.1 UPP对p53蛋白的调控
• p53蛋白是细胞内重要的凋亡 调控因子，可通过激活一系列 靶基因实现凋亡调控功能。 MDM2是E3家族成员，促进 p53从核内向细胞质转运，使 之被泛素化后降解，从而发挥 抗凋亡作用。 多种肿瘤细胞中发现UPP活性 上调，p53蛋白降解增加，肿 瘤细胞增殖明显上升。
•
•
2.2 UPP对转录因子NF-κB的 调控
• 细胞转录因子NF-κB可以激活 抗凋亡基因如bcl-2等，发挥 抗凋亡作用 。 正常情况下， NF-κB 活性被 IκB抑制 。 肿瘤细胞中参与IκB 降解的蛋 白酶体活性增加，细胞内NFκB 水平升高，细胞增殖增加。
蛋白质的泛素化降解总结
蛋白质的泛素化降解总结仅作参考，如有抄袭，依法追究目录：1.研究背景2.泛素化降解途径2.1泛素的基本结构2.2泛素化的过程2.3 E3酶对蛋白底物的识别2.4 蛋白底物在26S蛋白酶体中的降解3.研究的意义以及应用4.研究展望真核生物细胞中的蛋白质泛素化降解摘要：蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。
保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。
目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。
溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径,主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径。
泛素系统广泛存在于真核生物中，是精细的特异性的蛋白质降解体系。
泛素是一种序列保守的小分子蛋白质，蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体通过消耗ATP的方式降解。
泛素系统由泛素、26S 蛋白酶体、多种酶（E1、E2、E3去泛素酶等）组成。
其中E1和E2被称为泛素活化酶和泛素载体酶。
泛素连接酶E3负责连接泛素与特异性底物，这样泛素化底物可以被26S蛋白酶体降解为若干肽段。
泛素系统在真核生物中有非常重要的作用，通过降解蛋白质，调节细胞的分化、免疫，参与转录、分泌调控和细胞形成等，与人类的某些疾病有关。
本文就泛素系统的组成、调控机制和研究进展做一介绍。
关键字：泛素系统；E3；26S蛋白酶体正文：1.研究背景蛋白质在细胞内的降解是一个复杂的过程，但是又是一个高度有序的过程。
真核生物中蛋白质的降解绝大多数都是由泛素系统完成。
蛋白质首先是由泛素分子所特异性识别结合，在泛素分子的介导下，由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用，与26S蛋白酶体作用，被切割成多肽。
多聚泛素链可以还原成单体，循环使用。
泛素与细胞的多种生命活动有关，例如细胞生长发育过程中组织抑制因子的选择性降解；细胞周期中，周期蛋白选择性降解等。
研究生课 细胞周期调控与p53系列研究 细胞生物学课
Establishment of PACT knock-out mice model
Collaboration with Dr. Xiao Yang
PACT knock-out: embryonic lethal at E7.5
PACT KO mice display increased apoptosis
PACT
Smurf
MDM2
Ub
p53
PNAS ( 2007)
JBC (2010)
ATM
P
ARF
Apak
Ac
SET2
Me
p53
p53
NCB (2009) FEBS Lett (2010) Cell Signal (2008) MCBi (2010)
Mdm2 structure and its interacting proteins
PACT promotes p53 ubiquitination and degradation mediated by Mdm2
PACT inhibits the transcriptional activity of p53
Inactivation of PACT stabilizes p53 and induces p53-dependent apoptosis or growth retardation
Smurf stabilizes MDM2 and inhibits its autoubiquitination
Stabilization
Degradation rate
Ubiquitination
Smurf negatively regulates p53 dependent of Mdm2
组蛋白的泛素化与去泛素化.ppt
除了单泛素化，H2A/H2AX在DNA损伤时可发生K63位的多泛素化
负责H2A/H2B泛素化与去泛素化的酶
H2A-specific
Common to H2A/H2B H2B-specific
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Histone ubiquitinase
One E1(activating),
mutiple E2(conjugating),
substrate-specific E3(ligase)
E3主要有两大类: HECT(homologous to the E6-AP carboxyl terminus) 结构域家族，通过与泛素形成催 化作用所必需的硫酯键发挥作用 RING(really interesting new gene)结构域 家族，为E2和底物提供居留位点从而使 E2 催化泛素转移到底物上
FACT:facilitates chromatin transcription 二聚体，包括SPT16和SSRP1，能从核小体中置 换出H2A/H2B二聚体，进而促使染色体介导的转 录延伸抑制得到释放
Molecular Cell, MG Rosenfeld, 1(29), 2008
H2B
✓H2B monoubiquitylation and deubiquitylation can directly modulate the chromatin state by altering nucleosome stability, promoting partial nucleosome disassembly and reassembly, and regulating chromatin higher-order structure. ✓modulate chromatin indirectly through the binding or repulsion of specific readers, which call into action a plethora of proteins and protein complexes with diverse biochemical activities. ✓The direct and indirect mechanisms are not mutually exclusive E.g.relaxation of higher-order chromatin structure is expected to facilitate the access of H2Bub1 readers
泛素化对蛋白质的调节 PPT
这些小肽随后被细胞质中的蛋白酶降 解为氨基酸。在哺乳动物细胞内,UPS系统是 一个层次非常鲜明体系：细胞内只表达一种 泛素激活酶E1把泛素转移到大约50种泛素结 合酶 E2上, 每种E2都可以与许多E3泛素连 接酶相互作用,而E3泛素连接酶在细胞内大 约有 1 000个,它们负责特异性地结合底物 使其发生泛素化从而能被蛋白酶体降解。
在细胞内, UPS 能够快速地降解那些不正常的蛋 白质和一些短暂的控制一系列基本细胞生命活动 的调节蛋白。UPS 降解蛋白质是一个复杂的和受 到严密调控的, 并且是高度特异性的降解细胞内 许多蛋白质的过程。细胞是如何选择并以高度特 异的方式来降解蛋白质的呢？它是通过给需要降 解的蛋白质加上许多小的标签—泛素来标记需被 降解的蛋白随后这些蛋白被泛素蛋白酶体降解。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
靶蛋白的泛素化降解涉及以下 3 个连续的 过程：(1)泛素的活化,这个过程需要以 ATP 作为能量, 泛素 C 端的羧基连接到泛素活 化酶 E1 的巯基, 最终形成一个泛素和泛素 活化酶 E1 之间的硫酯键; (2)泛素活化酶 E1 将活化后的泛素通过交酯化过程传递给 泛素结合酶 E2; (3)泛素连接酶 E3 将结合 E2 的泛素连接到靶蛋白上。
泛素化对蛋白质的调节
泛素化修饰主要作用： 1.参与蛋白质降解 2.直接影响蛋白质的活性和定位
蛋白质降解： 泛素化修饰最早被发现的功能是标记靶蛋白, 使 之被蛋白酶体识别并降解, 整个过程涉及泛素分 子、底物蛋白和多种酶系统。 1.泛素-蛋白酶体系统（UPS）：泛素激活酶 （E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、 去泛素化酶、蛋白酶体，它们共同构成了泛素-蛋 白酶体系统（UPS）。
DNA 修复:
蛋白泛素化研究套路 概述及解释说明
蛋白泛素化研究套路概述及解释说明1. 引言1.1 概述在细胞内，蛋白质的功能和稳定性常常受到蛋白泛素化的调控。
蛋白泛素化是一种通过共价连接小分子泛素（ubiquitin）来修饰目标蛋白质的过程。
通过添加或移除泛素分子，细胞可以调节被修饰蛋白的活性、位置、相互作用等特性。
因此，研究蛋白泛素化对于理解细胞信号传导、生物过程及相关疾病具有重要意义。
1.2 文章结构本文将系统地介绍蛋白泛素化研究套路，并提供详细的解释和说明。
首先，在引言部分我们将概述该领域的重要性，并介绍文章后续内容的结构安排。
其次，我们将在第二部分讲述蛋白泛素化的定义、背景知识以及其在生物学中的重要性和应用领域。
接下来，第三部分将深入描述蛋白泛素化的机制，包括涉及到的泛素连接酶系统、底物识别和特异性控制机制以及其他调控蛋白泛素化水平的因素与途径。
在第四部分，我们将重点介绍实验技术在蛋白泛素化研究中的应用与发展，包括免疫共沉淀技术、小分子荧光标记技术以及体外重组和基因敲除技术。
最后，在结论部分，我们将对蛋白泛素化研究套路进行总结和归纳，并展望其未来的发展方向和可能性。
1.3 目的本文旨在提供一个全面且清晰的概述，详细介绍蛋白泛素化研究的套路、机制和实验技术应用。
通过阐述这些内容，读者可以更好地了解蛋白泛素化领域的重要性，并为从事相关研究或学习的科学家提供指导和参考。
同时，期望能够激发更多对于蛋白泛素化的兴趣，并促进该领域在生物医学和药物开发中的应用。
2. 蛋白泛素化研究套路2.1 蛋白泛素化的定义和背景知识蛋白泛素化是指通过共价连接在目标蛋白上的小蛋白质分子-泛素来调控该目标蛋白的功能和命运。
这种修饰过程包括泛素激活、泛素结合酶介导的底物连接和底物特异性识别等环节。
蛋白泛素化广泛存在于真核生物中，参与了多种细胞生理和病理过程。
2.2 蛋白泛素化的重要性和应用领域蛋白泛素化被认为是细胞中最主要、最普遍也是最关键的内源性调控系统之一。
它在维护细胞稳态、质量控制、信号转导、DNA修复以及细胞周期等方面起着重要作用。
暨南大学《分子生物学》复习题
暨南大学《分子生物学》复习题分子生物学复习题Macromolecules（大分子）Supercoil(超螺旋)：DNA双螺旋本身进一步盘绕称超螺旋。
超螺旋有正超螺旋和负超螺旋两种，负超螺旋的存在对于转录和复制都是必要的。
Palindrome（回文序列）：DNA序列中一条链从左到右阅读和另一条链从右到左阅读是一样的序列，即两条链由相邻的反向重复序列组成。
melting temperature（解链温度）：DNA在溶液中随温度升高逐步变性，当A260达到彻底变性时，A260的一半时的温度就叫解链温度（Tm），Tm与GC比例、序列复杂性等因素有关。
hyperchromic shift（增色效应）：当双螺旋DNA融解(解链)时,260nm处紫外吸收增加的现象。
Nucleosome（核小体）：真核生物染色体的基本结构单位，由DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4组成的，DNA以左手螺旋缠绕于组蛋白核心上Chaperones（伴侣蛋白）：与新合成的多肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构向的蛋白质Domain（结构域）：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域。
Motif（基序）：又称超二级结构，是蛋白质分子中特别是球状蛋白质分子中由若干相邻的二级结构与元件（主要是α螺旋和β折叠片）组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件。
protein family（蛋白质家族）：指具有相似结构，有某一功能共性的一组蛋白质。
Proteasome（蛋白酶复合物）：蛋白酶体存在于所有真核细胞的胞质及核内,是高度保守具有多种催化功能的蛋白酶复合物。
蛋白酶体具有蛋白水解酶活性,蛋白酶体水解作用需要泛素蛋白参加。
Ubiquitylation（蛋白质泛素化）：泛素间隔或连续地附着到被降解的蛋白质赖氨酸残基上，这一过程称为蛋白质泛素化。
泛素化蛋白修饰
K48 polyubiquitylation
K63 polyubiquitylation 调节蛋白质的活性和定位
Monoubiquitylation
调节蛋白质内吞，修饰和转录
Multiple monoubiquitylation 12
E3的种类
a. RING finger domain（SCF复合体，APC， MDM2， Parkin, 和c-Cb1） b. U-box domain（CHIP) c. HECT domain（能与底物形成硫酯键) d. N-End Rule
Cps35 Is Required for Translating Histone Crosstalk between H2B Monoubiquitination and H3 Methylation by COMPASS
Nrdp1 是一促进ErbB3及BRUCE泛素化
9
泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素 (ubiquitin，由76个氨基酸组成的多肽）共价 修饰的过程，在几乎所有的真核细胞活动中起 着关键作用。泛素 –蛋白酶体(proteasome)通 路则是真核细胞内最主要的蛋白质降解途径。 泛素化调控的细胞活动至少包括: 细胞周期（Cell cycle progression） 细胞凋亡（Apoptosis） 转录调控（Transcriptional regulation） DNA修复（DNA repair） 免疫应答（Immune response） 蛋白质降解及质量控制（Protein degradation and quality control )
泛素－蛋白酶体通路
Ub E1 Ub-E2 底物
ATP -E1 Ub
E3
泛素化的作用
泛素化的作用
• 生化功能
P53-Mdm2模块和泛素化系统
• Mdm2的表达是由p53来 调节，Mdm2作为E3连 接酶使p53泛素化并且 驱使p53降解，进而控 制p53的功能。对于 p53泛素化的结构要求 是p53的寡聚化。P53 泛素化作用的调整模 式是通过蛋白质之间 的相互作用。
UPP与疾病
泛素化过程和细胞周期的调控
• 在大多数情况下，泛 素化以及泛素化之后 的蛋白质降解只是细 胞生理生化反应体系 的一个环节。核转录 因子NF-KB（nuclear factor-kB)是1986年 首先于B细胞中发现的 一种结合于免疫球蛋 白k轻链增强子上的核 蛋白。Leabharlann 泛素化过程和细胞周期的调控
• 在正常情况下，NF-kB与其抑制物 IkB结合，存在于细胞质中，IkBα 遮蔽着NF-kB的细胞和定位信号， NF-kB的生物活性表现不出来。党 细胞受到外界环境（包括细菌或病 毒感染、炎症细胞因子、紫外线照 射、电离辐射）等刺激时， NF-kB 的抑制物IkB迅速被IkB激酶（IKK) 磷酸化。磷酸化的IkB通过一个泛 素连接酶复合物使其本身泛素化， 泛素化的IkB接下来被26S的蛋白酶 体降解， NF-kB则被释放到细胞核 中启动靶基因的表达。
由于NF-kB在肿瘤细胞中发挥着重要的抗凋亡作 用，因此抑制肿瘤细胞NF-kB的活性将引起肿瘤 细胞的生长。
泛素化与DNA修复的关系
化学生物学专业博士研究生课程精选全文
可编辑修改精选全文完整版化学生物学专业博士研究生课程教学大纲课程名称：蛋白质组学及应用课程编号：0703201F08学分：2总学时数：40开课学期：第2学期考试方式：笔试课程说明：（课程性质、地位及要求的描述）随着人类基因测序的基本完成，人类基因组计划开始进入后基因组时代。
蛋白质组学(Proteomics)已成为功能基因组学的重要研究领域，是当今生命科学研究的热点与前沿领域。
本课程主要从蛋白质组与蛋白质组学的基本概念入手，重点介绍这一崭新领域的诞生与发展，并以具体的研究成果，详细介绍蛋白质组学研究的相关技术及应用进展。
通过本课程的学习，使学生了解和掌握蛋白质的结构、功能基因组和蛋白质组、蛋白质组学研究的方法及相关分离、分析、检测、鉴定技术，蛋白质组学研究中的生物信息学及蛋白质组学的应用等，如肿瘤发生与发展的比较蛋白质组学、细胞凋亡的蛋白质组学、蛋白质组学与新药开发等方面的知识。
本课程主要适用于化学、化工、生物、医学等学科领域的研究生选修。
教学内容、要求及学时分配：第一章功能基因组与蛋白质组(2学时)1. 基因组、蛋白质组研究中的基本概念、相互关系2. 蛋白质组学研究的内容和意义3. 蛋白质组学的特点和难点及蛋白质组学发展趋势本章要求：了解基因组、蛋白质组研究中的基本概念、相互关系，蛋白质组学研究的内容和意义。
蛋白质组学的特点和难点及蛋白质组学发展趋势。
第二章蛋白质的结构与表征(2学时)1. 蛋白质的组成、分类2. 蛋白质的一级、二及、三级结构等基本概念3. 蛋白质结构与功能的关系4. 蛋白质结构分析的方法和技术本章要求：了解蛋白质的组成、分类、一级、二及、三级结构等基本概念，蛋白质结构与功能的关系，蛋白质结构分析的方法和技术等。
第三章蛋白质组学研究方法(3学时)1. 蛋白质组学研究的方法和技术2. 二维凝胶电泳技术3. 多维色谱分离技术4. 生物质谱鉴定技术本章要求：了解蛋白质组学研究的方法和技术，如二维凝胶电泳技术、多维色谱分离技术、生物质谱鉴定技术等。
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p53 can be activated by multiple stresses
DNA damage
Oncogenic insults
Kinases
• Non-proteolytic (mono-Ub or K63 Ub chain) DNA repair, transcription, kinase activation.
• Proteolytic (K48 or K29 linked Ub chains)
1) concentration control: key regulators (e.g. p53, cyclins, HIF)
350
Arabidopsis: 490
C3H2C3 (RING-H2)
ROC1 ROC2 APC11 PRAJA1 PARKIN
CAICRNHIMD LCIECQA NQASATSE ECTVAWG VCNHAFHFHCISRWLKTRQ---V CPLD cell cycle control CAICRVQVMD ACLRCQA EN---KQE DCVVVWG ECNHSFHNCCMSLWVKQNN---R CPLC unknown CGICRMAFNG CCPDCKV P-----GD DCPLVWG QCSHCFHMHCILKWLHAQQVQQH CPMC mitotsis CPICCSEYVK---------------GEVATELP CHHYFHKPCVSIWLQKSG---T CPVC unknown CITCTDVRSP-----------VLVFQCNSRHVI CLDCFHLYCVTRLNDRQ [11]P CVAGC parkison disease
➢ Proteasome inhibitor Velcade: multiple myeloma ➢ UPS: targets in anti-cancer therapy ➢ E3s: determine substrate specificity, better targets
Cancer, Huntington’s disease, spinocerebellar ataxias, Paget’s disease of bone, AIDS-related cancer, muscle wasting, cystic fibrosis, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, hypertension, etc.
Two families of E3 ubiquitin ligases
E3
? substrate
? E2 -S-Ub
Ub UbUbUbUb
RING family E3 (1000s)
HECT family E3 (~40)
Cullin
adaptor
ROC
substrat
Ube
Ub Ub UbUb
Ubiquitin-proteasome system (UPS)
Daniela Hoeller et al. Nat. Rev. Cancer, 2006, 6, 776
Protein Ubiquitination
RING E3 HECT E3
Functions of the Ub system
E2
Ub
MDM2 RING
p53
Ub Ub Ub UbUb
E2
Ub
E6AP HECT
substrate
Ub Ub Ub UbUb
E2
Ub
RING Finger Genes
RING: Really Interesting New Gene
X(4-48)
C1
C6
C/H4 C67
X2 Zn ++ X2
X2
X(1-3) Zn ++ X2
C2 C5
C/H3 C78
X(9-27)
RING finger
X2
C1
C4
X2 Zn++ X2
C2 H3
C5
C8
X5 Zn ++ X2
C6 C7
X17
X17
Zinc finger
RING Finger Genes
Yeast:
39
Worm:
154
Fly:
135
Human:
C3HC4 (RING-HC)
c-Cbl Siah BRCA1 BARD1 MURF PML IAP1 IAP2 IAP3
CKICAENDKD------------------ VKIEP CGHLMCTSCLTSWQE SEG--QG CPFC CPVCFDYVLP-----------------PILQ CQAGHLVCNQCRQKL-------SC CPTC CPICLELIKE------------------PVSTK CDHIFCKFCMLKLLNQKKGPSQ CPLC CSRCANILKE-----------------PVCLGG CEHIFCSGCISDCVGS-----G CPVC CPICLEMFSK-----------------PVVILP CQHNLCRKCANDVFQ[18]RFR CPSC CQQCQAEA KC------------------PKLLP CLHTLCSGCLEASGM------Q CPIC CKVCMDKEVS-----------------IVFIP CGHLVVCKDCAPSLRK------- CPIC CKVCMDKEVS-----------------VVFIP CGHLVVCQECAPSLRK------- CPIC CKICMDRNIA-----------------IVFVP CGHLVTCKQCAEAVDK------- CPMC
Daniela Hoeller et al. Nat. Rev. Cancer, 2006, 6, 776
Ubiquitin and ubiquitin-like proteins
Ubiquitin-mediated Proteolysis
E1 -S-Ub
Lys-48
E2 -S-Ub
E3 ?
C terminus
NF-κB signalling pathways
canonical pathway Non-canonical pathway
Ubiquitin
Lys-48
Gly-76
Human Ub: MQIFVKTLTGKTITLEVEPNDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGG Yeast Ub: MQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG
p300 102-222
RB 273-321
ARF 210-244
438-491
Mdm2/MdmX
412-437
Gankyrin
1 19
102
Mdm2 p53 binding
Ubc9 Smurf1
40-59 75-114
Akt
S166/S186 221
ATM
274 305 322 S395
* * acidic
Functions of Ubiquitination-mediated protein degradation
• 细胞周期和细胞分裂、分化 • 发育的调节 • 细胞对外环境的应激反应的调节 • 神经网络的形态发生 • 细胞表面受体和离子通道的下调 • DNA修复 • 免疫和感染反应的调节 • 细胞器的生物生成 • ……
NLS NES
181-185 191-205
Zn
*
L5/L11/L26
284-374
438 478 491
RING
NoLS
464-471
MDM2 ubiquitinates p53
UbcH5 + + MDM2 - + +
++ -++
poly ubiquitinated p53
12 3
456
Honda et al. (1997) FEBS Letter 420:25
C2H2C4
HDM2
CVICQGRP KN---------------GCIV HGKTG HLMACFTCAKKLKKRNK---P CPVC control p53
How Many E3 Ligases?
Proteases:
550
Kinases:
520
Phosphatses:
150
DNA polymerases:
Lingqiang Zhang, Ph.D Professor, Principal Investigator Dept. Proteomics & Genomics (P&G) Beijing Inst. Radiation Medicine (BIRM) Tel: 66931216 Email: zhanglq@
16
E1:
16
E2:
53
E3:
>1000
Cullin-ROC complexes 300 - 500
RING proteins
450
HECT proteins
~40
U-box proteins
10 - 20
Ubl ligases
?
Single-subunit RING type E3: Mdm2
MDM2 structure and interacting proteins