细胞周期分析重要知识

细胞周期生物学基础

细胞的生成依赖于细胞的分裂而产生两个子代细胞的过程。在分裂过程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包含了细胞的遗传信息载体-DNA。在绝大多数情况下，一个生物体的每个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。因此，细胞在分裂前必须复制DNA这样它的子代细胞就能够拥有与父代相同的DNA含量。

细胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代继续复制并分裂，这个过程称之为细胞周期。在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在此时细胞开始分裂其自身-有丝分裂期。细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期（合成期）和M期（有丝分裂期）。

当细胞周期中的S期和M期被定义后，我们可观察到在有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开始之时。这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。这样整个细胞周期可划分为G1 →S →G2 →M →G1，如下图所示：

图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征

当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征，我们称这些细胞为G0期细胞。

一些发生在G1和G2期细胞内的生物过程现还不完全明了。处于G1期的细胞已开始为分裂前的DNA的复制和细胞成长准备许多RNA和蛋白分子。处于G2期的细胞则会修复在DNA复制过程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。

细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。典型细胞循环中各期的发展时间为：G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期0.5小时。

分析和流式细胞术细胞周期分析

流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色（染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关）。有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与DNA分子结合的位点不同。

现用得最多的两种DNA结合染料是蓝光激发的碘化匹啶（PI）（或偶尔也有用EB）和紫外激发的DAPI和Hoechst染料33342和33258。PI染料是一种插入性的与双链DNA和RNA（当要特异地检测DNA时，经常使用RNAse去除RNA）结合，而DAPI和Hoechst染料仅与DNA的螺旋结构的亚级凹槽结合并与RNA完全没有任何结合。Hoechst 33342是现唯一令人满意的能对活细胞DNA 时行染色的染料。其他一些染料在染色前需要破坏细胞膜，故经常使用去污剂或低渗溶液处理或溶剂进行固定（酒精）。

*注意：使用溶剂进行固定（如酒精）经常会引起细胞聚集，详情见分析细胞聚集。

当运用DNA结合荧光染料后，可观察到一个有特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。

当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析，会观察到一个很“窄”荧光峰。它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。因为种种原因G1期细胞具有相同的DNA含量，理论上G1期细胞的DNA含量荧光强度应当一致，并在直方图上的一个通道上出现信号（如图2.2A中，在直方图上出现一条G1期细胞的荧光直线）。

图2.2分别显示了一个理想状态中一台完美的流式细胞仪无偏差检测的直方图（A）和实际分析得到的呈高斯分布的直方图（B）。在B图中，使用Dean 和Jett 多项式S期分析模型进行分析识别出的G1、G2和S期细胞分布。

如果流式细胞仪十分完美且DNA染料的特异性绝对专一，这种情况将会发生。而在实际中，流式细胞仪本身存在着许多变异性，此外DNA染料的着色也存在生物学的变异。因此，检测得出的G1期细胞的荧光分布正常的是呈高斯曲线分布。这种“钟”型分布与检测的变异相关（图2.2B）。

检测中的变异越大，高斯曲线的宽度越宽。有一个名为“变异系数”（CV）的指标用于描述峰的宽度。CV是一种规格化的标准差，定义为CV=100*标准差/平均值。

相类似，G2和M期细胞它们拥有两部的正常G1期细胞的DNA含量，从而在直方图上形成一个两倍于G1信号峰D.I.2.0的高斯峰（见图2.2）。

实际上，G2/G1的比值常小于2.0，可能是因为G2期细胞的DNA-蛋白（染色质）聚集得更紧密或更浓缩。从而DNA染料着色时与DNA位点的结合能力被削弱。最常见的G2/G1的比值是1.97。

在理论上的完美流式细胞仪上检测时，S期细胞将分布自所有G1期细胞直方图右侧并一至延伸到所有G2期细胞直方图的左侧。因为细胞一旦开始进入S期便会开始合成DNA，并紧帖着G1期细胞开始向外延伸。而后DNA含量不断增加直至完成S期阶段进入G2期。

不幸的是，实际中的直方图分布并不是如此简单，这是因为G1、G2期的DNA峰分布并直线，而是有宽度的高斯分布，而S期分布则更宽。所形成的结果是早期S期细胞与G1期细胞相互叠加，而后期S期细胞与G2期细胞相互叠加。区分这些叠加细胞而计算出正确的G1、S和G2期细胞是以下章节讨论的内容。

二倍与异倍体细胞的DNA含量

正如前面介绍的那样，机体所有的G1期细胞，极少例外，都具有相同的DNA含量和染色质结构。在哺乳动物中，每个染色体具有两条构成。这在细胞遗传学者认为是具有“双重DNA含量”（根据实际观察到的染色体数量）的细胞，并且定义了“2N”来描述它们（N是指单个染色数量，单倍染色体的DNA含量）。而流式细胞仪通常也有相关的术语来描述：“DNA指数（D.I.）1.0”来指代这些G1期细胞的DNA含量。

具有其他DNA含量的细胞并意味着一定是属于异常，如以上介绍的S期和G2细胞和仅有单倍染色体生殖细胞，及一些在体内具有四倍DNA含量（D.I.2.0）的细胞（其他例外情况，如存在少数多核细胞）。所有这些细胞的DNA都具有“整倍”关系，它们之间的差别都是以完整的染色体组为单位的，而这些染色体组中的各染色体都拥有其自身的完整性。任何DNA含量异常的细胞其染色体组首先发生的异变或致少染色体的结构发生了改变，这们将这些细胞称为“异倍”DNA含量（针对于整倍体之言）。

因为整个细胞或细胞核DNA流式细胞仪无法确切检测出染色体数量，流式细胞仪无法确定哪些是DNA指数为1.0的正常细胞，所以要使用已知样本来事先定义二倍体细胞。

同样的，当细胞的DNA指数为2.0时我们称之为G2期细胞，或四倍体细胞或一个拥有异常DNA 含量的异倍体细胞。在流式细胞仪进行检测时，它的位置事先也要精确地进行定义。

流式细胞仪通过观察DNA指数为非1.0整倍的细胞而能检测出染色体的变化，但这些细胞的染色