临床生化检验参考方法

国际计量局物质量咨询委员会（CCQM）
•由国际计量局（BIPM）国际计量委员会于1993年成立 包括35个会员和观察员组织 •下设7个工作组 ，每年召开两次工作会议 •针对不同领域，每年开展多项国际间比对活动
CCQM-P77b
2006年进行，由美国NIST发起，参加的机构包括

完成血清葡萄糖、尿酸参考方法的建立 完成血清甲状腺素、雌二醇、皮质醇参考
方法的建立 参考方法的应用工作
谢谢！
血清尿素
H3 C
H2 N H2 N
C O
MDBMA HCl
N OH N
MSTFA
N O N
Si
CH3 CH3
(Ⅰ)
(Ⅱ)
(Ⅲ)
(Ⅰ):尿素（碳酰胺）； (Ⅱ):2-羟基嘧啶； (Ⅲ):尿素衍生产物（ 三甲基硅烷氧基嘧啶）
图 尿素衍生化反应过程
血清尿素
a：尿素；b：内标
图2 GC/MS分析尿素和内标衍生产物的色谱图
血清尿素

方法学评价 （1）精密度： 批内、批间和总变异系数的平均值分别为0.38%（ 范 围0.12%～0.47 %）、0.62%（范围0.49 %～0.87 %） 和0.73%(范围0.51%～0.93 %)。 （2）回收率 回收试验的回收率范围为99.37 ～100.95%。 （3）参考物质分析： 分析美国国家标准和技术研究院（NIST）2个水平的 血清标准物质SRM909b，测定结果与靶值的偏差小于 0.2%
美国国家标准和技术研究所 NIST 中国计量科学研究院 NIM/NRCCRM 德国国家计量研究院 PTB 日本国家计量研究院 NMIJ 韩国标准与科学研究所 KRISS 新西兰惠灵顿医院 Wellington Hospital，New Zealand
比对样品
• 冰冻人血清（每种5ml×4瓶） 男性血清：正常成年男性 女性血清：正常成年、非绝经期女性 •每种血清中的3瓶供正式测定 余下1 瓶用于预实验或结果的验证
比对结果— — 女性血清
参与实验室 NIST（美国） NIM（中国） PTB（德国） NMIJ（日本） Wellington Hospital (新西兰) KRISS （韩国） 测定结果 标准不确定度 扩展不确定度 （ng/g） （ng/g） （ ng/g）
1.876 1.90 1.946 2.26 1.75 0.023 0.02 0.025 0.043 \ 0.047 0.04 0.061 0.087 \ 未报回数据
色谱/质谱联用测定系统
液相色谱/串联质谱系统
高效液相色谱仪Agilent 1200和串联三重四极杆质谱仪API 4000
血清孕酮
方法
（1）以[3,4-13C2]孕酮为内标，用正己烷提取血清 （2）以羟丙基-β-环糊精水溶液对提取液作净化处理 （3）用七氟丁酸酐对孕酮进行衍生化 （4）用气相色谱分离衍生产物，质谱选择离子监测模 式检测孕酮与内标的特定碎片离子 （5）包括法定量
a：肌酐；b：内标 图 LC/MS/MS分析肌酐和内标的色谱图
血清肌酐
与干扰物质肌酸的分离
a：肌酸；b：肌酐 图4 LC/MS/MS测定肌酐与肌酸的色谱图
血清肌酐
方法学评价 （1）精密度： 批内、批间和总变异系数的平均值分别为0.57%（ 范 围0.52%～0.61 %）、0.43%（范围0.11 %～0.59 %）和 0.73%(范围0.62%～0.83 %)。 （2）回收率： 加样回收试验的回收率范围为99.09%～101.13%。 （3）参考物质分析： 分析两种参考物质SRM 909b和SRM 967b，测定结果 与认定值的偏差小于0.4%。
RELA-2007
比对样品：A、B两水平，每水平个5瓶。 比对结果：2008年5月中旬报告
血清尿素
方法
（1）以[13C,15N2]尿素为内标 （2）用无水乙醇沉淀、去除血清中的蛋白类物质 （3）依次使用丙二醛-二甲基缩醛和N-甲基-(三甲 基硅烷基)-三氟乙酰胺（MSTFA）将尿素衍生成 为三甲基硅烷氧基嘧啶 （4）用GC/MS分析衍生产物，以包括法定量
1、代谢物类：胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌酐、尿酸、尿素 2、离子类：钠、钾、氯、钙、镁 3、酶学类：丙氨酸氨基转移酶、 -谷氨酰转移酶、天门冬氨酸 氨基转移酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶 4、非肽激素类：T3、T4、孕酮、雌二醇、皮质醇 5、脂蛋白类：高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇
下一步工作计划
比对样品
• 冰冻人血清（每种 5ml×4瓶） 女性血清：正常成年、非绝经期女性 • 每种血清中的3瓶供正式测定 余下1 瓶用于预实验或结果的验证
比对结果
参与实验室 测定结果 （ng/g ） 3.15 2.891 2.74 2.88 2.806 2.799 2.85 2.834 标准 不确定度 （ng/g ） 0.12 0.0846 0.04 0.04 0.035 0.038 0.031 0.038 扩展 不确定度 （ng/g） 0.23 0.1861 0.09 0.08 0.07 0.076 0.063 0.085 分析方法
Progesterone, ng/g
2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3
比对结果
LGC
NMIA
NIST
PTB
NMIJ
NIM
KRISS
CENAM
RELA-2007


2003年，国际临床化学联合会（IFCC）为配合检验医学 溯源联合会（JCTLM）的工作，与德国临床化学会 （DGKL）共同发起的环形比对试验（Ring-trial），每年 进行一次。 参加2007-RELA激素类比对

同位素稀释/色谱/质谱联用技术

目前国际公认的可准确测定小分子化合物的方法 可用于一级参考测量过程的测量原理 同位素内标 “ 理想” 的内标物，与待测物没有结构上的差异 色谱/质谱联用测定系统 高特异性 高灵敏性


色谱/质谱联用测定系统
气相色谱/质谱联用系统 Agilent 6890 N /5975 MSD
工作背景
国家“ 十一五” 科技支撑计划资助项目
（2007BAI05B09） 国家863计划资助项目 (2006AA020909)
工作背景
检验项目 1、代谢物类：胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌酐、尿酸、尿素 2、离子类：钠、钾、氯、钙、镁 3、酶学类：丙氨酸氨基转移酶、 -谷氨酰转移酶、天门冬氨酸 氨基转移酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶 4、非肽激素类：T3、T4、孕酮、雌二醇、皮质醇 5、脂蛋白类：高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇 （共约24项）
临床生化检验参考方法 建立的工作进展
张天娇 卫生部临床检验中心
工作背景
检验结果的准确性和可比性已受到广泛的重视，
提高和保证检验结果的准确性和可比性的有效手 段是开展量值溯源工作，而检验量值溯源的基础 是参考系统。
临床检验参考系统包括参考方法、参考物质和参
考实验室，其中参考方法是关键，参考物质由参 考方法定值，参考实验室是运行参考方法的实验 室。
CENAM（墨西哥）
ID-GC/MS ID-C/MS/MS ID-C/MS/MS ID-GC/MS ID-C/MS/MS ID-C/MS/MS ID-GC/MS ID-GC/MS
KRISS（韩国） LGC（英国） NIM（中国） NIST(美国) NMI（澳大利亚） NMIJ（日本） PTB（德国）
分析方法
ID-LC/MS/MS ID-GC/MS ID-GC/MS ID-LC/MS/MS 免疫分析法
比对结果— — 男性血清
参与实验室 NIST（美国） NIM（中国） PTB（德国） 测定结果 标准不确定度 扩展不确定度 分析方法 （ng/g） （ng/g） （ng/g） 0.0402 0.0032 0.0063 ID-LC/MS/MS 0.045 0.003 0.006 ID-GC/MS 未报回数据 未报回数据 \ \ 未报回数据 免疫分析法
血清肌酐
拟参加相关国际比对：RELA-2008
其他重要项目参考方法的建立
血清胆固醇
HPLC法 ID-GC/MS法 ID-LC/MS/MS法 血清总甘油三酯 HPLC法 ID-LC/MS/MS法 脂蛋白类 超速离心-HPLC法 酶学 无机离子：血清钠 ICP-MS 法
总结
已基本完成参考方法建立的项目
血清孕酮
CH3 C O
HFBA
CH3 C O
O O F7C3 C O
(Ⅰ)
(Ⅱ)
Leabharlann Baidu
(Ⅰ) 孕酮(孕甾－4烯-3，20－二酮) (Ⅱ) 孕酮衍生产物（孕甾-3，5-二烯-20-酮-3-七氟丁酸酯） 图：孕酮和内标的衍生化
血清孕酮
1. 孕酮 2.内标 图3同位素稀释/气相色谱/质谱法测定血清孕酮（A）和内标（B）色谱图
血清孕酮
方法学评价
（1）精密度： 血清孕酮测定的总变异系数为0.69%～2.12% （2）回收率： 平均分析回收率为98.3%～100.1%。 （3）参考物质分析: 分析血清孕酮标准物质ERM-DA347，测定结 果 与靶值得偏差小于1.5% 。
血清孕酮
参加国际比对的情况
CCQM-P77b（与中国计量科学研究院合作） CCQM-K63b（与中国计量科学研究院合作） RELA-2007
血清尿素
参加国际比对
RELA-2007
血清肌酐
方法
（1）以[2H3]肌酐为内标， （2）用无水乙醇沉淀血清中的蛋白质 （3）用氯仿纯化 （4）用液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）分离测定 （5）以包括法定量。
血清肌酐
图
肌酐和内标一级全扫描质谱图和主要相关离子图
血清肌酐
图 肌酐[M+H]+离子（母离子）二级全扫描质谱图和主要子离子图
NMIJ（日本） Wellington Hospital 0.063 (新西兰) KRISS（韩国）
比对结果— — 女性血清
比对结果— — 男性血清
CCQM-K66b
2007年进行，由美国NIST发起，参加机构包括

美国国家标准和技术研究所 NIST 中国计量科学研究院 NIM/NRCCRM 德国国家计量研究院 PTB 日本国家计量研究院 NMIJ 英国政府化学家实验室 LGC 墨西哥国家计量科学研究院 CENAM 澳大利亚国家计量科学研究院 NMIA