博士德ELISA试剂盒一般操作流程
ELISA试剂及操作步骤
操作方法1、包被：用包被液CBS稀释包被抗原至菌含量为2×108cfu，酶标板中每孔加入50μl，湿盒内室温或4℃或37℃过夜包被。
2、洗涤：弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。
3、封闭：每孔加封闭液（1%BSA）250μl，（10ml 5%。
0.5g）37℃封闭2h。
4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，要设立阴性对照，37℃孵育1.5h。
6、洗涤：同上。
7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP（稀释倍数根据产品不同有所不同，可按说明书进行）50μl，37℃孵育1.5h。
8、洗涤：同上。
9、显色：每孔加底物溶液（OPD）50μl (配10ml) ，置室温暗盒内显色10min。
10、待显色后，每孔加入50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。
使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平。
ELISA 检测所用主要试剂：包被缓冲液：0.05mol/L ，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS ）Na 2CO 3 l.59gNaHCO 3 2.93g加去离子水水至1000ml ，调pH 值到9.6。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS ）：0.01 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO4 0.2gKCl 0.2gNa 2HPO 4·12H 2O 2.9g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
10×PBS ：0.2 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO 4 2.4gKCl 2.0gNa 2HPO 4·12H 2O 36.05g 或Na 2HPO 4 14.4g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
ELISA检测试剂盒操作流程
ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。
-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。
- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。
2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。
-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。
3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。
- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。
-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。
4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。
-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。
-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。
5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。
-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。
6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。
-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。
-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。
7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。
-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。
8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。
-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。
9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。
-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。
-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。
总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。
博士德ELISA试剂盒一般操作流程
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。
试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。
每次检测都应该做标准曲线。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。
总数=样品数+9；做双份检测时×2。
其余重包装好放如冰箱中。
2. 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml 的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。
对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。
3. 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。
不洗。
5. 将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。
（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。
此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical density）记录。
通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）有两种设定空白对照的方案：（1）将TMB空白显色孔设为对照。
Elisa试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法Elisa试验广泛应用在免疫学检验的各领域中，那么Elisa试验有没有简单便捷的操作方法呢？ELISA试剂盒操作方法具体如下：ELISA试剂盒操作方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA试剂盒操作方法二：用于检测未知抗体的间接法：1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
2.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）3.于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
4.于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟5.于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml6.可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
ELISA操作流程及技术要点
编号 pg/mL
S7 2000
S6 1000
S5 500
S4 250
S3 125
S2 62.5
S1 31.25
S0 0
1. 2
洗液工作液
浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取 240mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL 浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤 液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
2
重要提示
1、实验开始前，请提前配置好所有试剂。试剂或样 本稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 2、用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心 数分钟，以便管盖和管壁上的液体集中到管底。 3、在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的 稀释液配制，不能混淆。 4、因实际装量多于标示装量，配制工作试剂请用精 准的计量工具（移液枪或量筒等）量取，切勿不经量 取直接使用。 5、标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物 酶标记亲和素工作液稀释前根据预先计算好的每次实 验所需的总量配制 ，实际配制时应多配制 0.1-0.4mL 。 请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工 作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。 6、标准品的稀释请勿于板中进行，标准品应于临用 前 15 分钟内配制。为保证实验有效性，建议每次实验 使用新的标准品。若保存得当，溶解后的标准品 S7 可 在 2-8 ℃保存， 7 天内使用有效。
4 、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须 覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育 过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温 育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。 5 、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 (1)手工洗板方法：吸去（不可触及孔壁和孔底）或甩掉 酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下 用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液按 200μL/孔注入孔内， 浸泡2分钟。根据操作步骤中所述，重复此过程数次。 (2)自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用 到正式实验过程中。 6 、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应 尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一 下显色情况以控制反应时间（比如每隔10分钟）。当肉眼可 见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时， 即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液 的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。 7 、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须 弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
Elisa方法
ELISA试剂盒protocol
一.试剂准备：
使用前,将所以时间放置室温15min，可以缓慢的摇晃加速沉淀溶解，稀释的工作液，需要立即使用；
二.标准品准备：用Reagent Diluent稀释
三.实验方法
1．用PBS稀释Capture Antibody 至工作浓度，马上用100ul/孔稀释的抗体铺平板,密封平板至室温抚育过夜;
2．吸干平板,每孔用400ul Wash buffer清洗,反复洗三次,最后一次洗版,倒置平板,放置于吸水纸上,充分吸干剩余的Wash buffer;
3．每孔中加入300ul Reagent Diluent 封闭板子至少1h;
4．重复步骤2,此时板子可以用于检测样品;
5．加100ul样品,标准品/孔,封板,室温抚育2h;
6．重复步骤2的洗板子过程;
7．加100ul detection Antibody(预先稀释),封闭,室温抚育20min(避光)；
8．重复步骤2的洗板子过程;
9．加100ul Streptavidin‐HRP 工作液，封闭，室温抚育20min(避光)；
10．重复步骤2的洗板子过程;
11．加100ul Substrate solution,室温抚育20min(避光)
12. 加50ul stop solution,彻底混合；
13. 用450nm测OD，540nm，570nm可以做校准波长；。
ELISA操作流程
ELISA操作流程前处理1．匀浆样本：取一定量（约100—150g）的样本进行匀浆，匀浆样本以无颗粒状为为佳.样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本,以充分混合不同个体的样本,达到均质的效果。
2．称量样本：利用0.01g当量的电子天平称量相应的样本重量，误差尽量控制在±0.02g,以提高结果的准确度。
样本直接称取到50ml离心管中。
称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品.3．加入提取液：在相应的样本中加入对应的提取溶剂，溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。
4．提取或萃取：加入相应的提取溶剂以后,拧紧离心管盖，利用涡旋仪充分振荡样品,以样本与提取液充分混合为准。
具体时间可参考说明书所提供的方法时间要求。
5．离心：把处理好的样品对称放置在离心机中，盖上离心机盖门，直到听到离心机盖门关闭声音，按“离心”键进行离心,离心时间一般设为5min，离心速度一般设为4500rpm/min。
如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6．移取液体:利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中；如果需要吹干浓缩的样品,则移取到干净干燥的玻璃管中；如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体，利用下层进行分析。
移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层，以免造成污染。
7．浓缩吹干：先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗，具体方法是先打开空气压缩机的开头，先通以少量气流，把装有甲醇的容量浸泡针头前端，浸泡时间约1-2s即可。
润洗针头后，把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上，再打开气流阀门，以能感觉到气流声音为准,再缓慢把针头伸到液面上方，以吹动液面为限，在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度，以节省吹干时间。
吹干的样品以没有液体流动的判定依据，亦可在吹干后再吹大约2—3min左右。
严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作.8．复溶：加入对应的复溶工作液后,再加入相应的除杂溶剂，利用涡旋仪振荡溶解，此步骤时间不宜过长，大约10s左右即可。
ELISA操作规范
ELISA操作规范目前实验室进行ELISA方法建立的人员越来越多，为了减少因人员操作导致的实验误差，避免因仪器试剂公用导致的相互之间的干扰，便于实验结果的分析和评价，实验室准备建立统一的ELISA操作流程，请大家以后按此规范统一操作。
1.包被：准备干净的槽子，根据要包被的酶标板的数量（N）取10Nml的1*包被液到槽子中，取要包被的蛋白放置在冰盒上，吸取所需要体积的蛋白（用带滤芯的低吸附的Tip 头），特别要注意Tip头不可伸入液面太深，只需伸入液面1毫米左右，保证吸取到蛋白即可，如果发现此步操作Tip蘸的蛋白较多，则重新吸取。
蛋白加入到包被液之前，Tip头在蛋白保存管的内壁上稍做停靠以让Tip头尖尖上蘸的一点点蛋白吸附到蛋白保存管得内壁上。
加入蛋白到包被液之后，应该反复吹打几次，之后用大体积的移液器吹打混匀（枪或者枪头需要带滤芯）最后用排枪再吹打几下之后加入到酶标板中，每孔100微升，打出液体时，Tip头尽可能的接近酶标板的底部，垂直加入。
这时蛋白开始在酶标板上的包被，应立即将其用质量好的干净封口袋密封，并放入到冰箱指定位置。
包被过程完之后记得将包被液及时放回冰箱。
2.封闭：包被到时的酶标板取出之后甩掉孔内液体，并且尽量拍干板子，之后用洗涤液洗涤两次，每孔110微升，洗涤浸泡时间1分钟左右，第一遍板子正放从左往右加洗涤液，第二遍上下颠倒从左往右加。
两次洗涤完之后尽量拍干板子，每孔加入110微升的封闭液SB（每次吸取和吹打SB的时候，移液器的手法要保持一致，SB有一定的吸附性，容易挂枪头壁，可以吹打第一次之后适当的短暂停留之后再吹打一次，或者适当降低吹打的速度，让其在吹打的同时在重力的作用下自己向下流），用封口袋密封，37℃温箱平放，封闭1小时之后用多道移液器吸取出封闭液SB到一个干净的槽子，板子用中等力度的多拍几下以去掉蘸在孔壁的SB（SB有一定的吸附性，孔底仍然会留有一些），然后倒扣在37℃温箱干燥2小时。
ELISA检测试剂盒操作流程
定量测定人血清中幽门螺杆菌（Hp）IgG抗体
ELISA检测试剂盒操作流程
一、操作流程：
1.根据需要，将若干孔德条带放置在支架上；
2.将标本、阴性质控、阳性质控以及标准品作1：200稀释（将５μｌ样品加稀
释液稀释到1ml，混匀）；
3.取100μl已稀释的血清样品、标准品和阴性质控、阳性质控加入相应得孔板
内（质控和标准品至少需做两孔），A1孔不加液体作为空白底色；
4.在37℃温箱中放置30分钟；
5.到时间后将孔被液体甩去，并用1X洗涤液反复清洗4次，最后用蒸馏水洗
一次；
6.在每孔内加100μl酶结合物（需按比例稀释，除A1孔外），轻微混匀；
7.在37℃温箱中放置30分钟；
8.甩去孔内酶结合物，用1X洗涤液反复清洗4次，最后用蒸馏水洗一次；
9.在每孔内加100μlTMB（使用前混合Ａ液和Ｂ液）（包括A1孔也加），轻微
混匀；
10.37℃放置15分钟；
11.每孔加50μl 1N硫酸终止液（包括A1孔），轻微混匀；
12.在15分钟内，用酶标仪在450nm处读取吸光度值（OD值）（将酶标仪A1
孔设定为空白孔）。
二、结果换算：
以标准样品的OD值为轴，标准样品的数值为X轴，在方格纸或计算机上作出标准曲线，然后根据标本的OD值读数在标准曲线上读出相应的IgG抗体浓度。
三、结果判定：
阴性：抗体浓度≤20u/ml为正常
阳性：抗体浓度＞20u/ml为阳性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子，如抗体、抗原、蛋白质等。
ELISA操作规程是进行ELISA 实验的关键，它确保实验的准确性和可重复性。
本文将详细介绍ELISA操作规程的内容。
正文内容：1. 准备实验材料1.1 准备试剂和标准品：根据实验需要，准备适当的试剂和标准品，如抗体、底物、酶标记物等。
确保试剂的保存条件符合要求，标准品的浓度准确。
1.2 准备样本：收集样本后，按照实验要求进行处理和储存。
确保样本的质量和数量满足实验需求。
2. 准备实验设备2.1 洗板机：清洗洗板机，确保洗板机的清洁度，避免交叉污染。
2.2 酶标仪：校准酶标仪，确保测量结果的准确性。
2.3 微量移液器：校准微量移液器，确保样品的准确加入。
2.4 96孔板：准备好96孔板，标记好每个孔的内容。
3. 进行实验步骤3.1 固定抗原：将待测抗原加入96孔板中，使其吸附在孔壁上。
3.2 阻断：加入阻断剂，阻断非特异性吸附位点。
3.3 添加抗体：加入特异性抗体，与抗原结合。
3.4 添加酶标记物：加入酶标记的二抗或底物，与抗体结合。
3.5 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔壁，去除未结合的物质。
3.6 反应底物：加入底物，使酶催化反应发生。
3.7 终止反应：加入终止液，停止酶催化反应。
4. 测量和数据处理4.1 使用酶标仪测量吸光度值，记录每个孔的读数。
4.2 绘制标准曲线：根据标准品的吸光度值，绘制标准曲线。
4.3 计算样本浓度：根据样本的吸光度值，通过标准曲线计算样本的浓度。
5. 实验注意事项5.1 严格按照操作规程进行操作，避免实验误差。
5.2 保持实验环境的清洁和无菌，避免污染。
5.3 注意实验材料的保存和使用期限，确保实验结果的准确性。
总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的重要指南。
准备实验材料和设备、按照规定的步骤进行实验、正确测量和处理数据以及注意实验细节是保证实验结果准确性和可重复性的关键。
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
elisa 试剂盒操作步骤
操作步骤1．取出试剂盒室温平衡30min，取出血样放至室温。
2．配标准品：取150uL标准品加入150uL标准品稀释液稀释，依次稀释5次。
3．加样：分别于各反应孔中加入标准品50uL，样品40UL，标准品做复孔，样品做3孔。
4．分别于样品孔中加入10UL抗体。
5．标准品和样品孔中分别加入50uL链酶亲和素-HRP，盖上封板膜,轻轻震荡混匀，37℃温育60min。
6．配洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
7．洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200uL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
8．显色：每孔先加入显色剂A 50uL，再加显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色6min。
9．终止：每孔加入终止液50uL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。
10．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。
测定应在加终止液10min 之内进行。
22．保存结果，收拾桌面。
12．分析处理数据注意事项1. 取出板条前恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，其余不用试剂应盖好。
2. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
3．实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
4．洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
5．试剂盒内试剂请在保质期内使用，不同批号试剂不要混用。
6．1000pg/ml以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
大于1000pg/ml 的样品应以标准稀释缓冲液稀释后重做。
在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫测定技术，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在。
本操作规程旨在详细描述ELISA实验的步骤和操作要求，确保实验结果的准确性和可重复性。
二、实验材料和仪器1. 实验材料：- 微孔板：96孔的ELISA板- 抗原或抗体样品- 酶标记的二抗或底物- 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的缓冲液- 反应缓冲液：用于稀释样品和试剂的缓冲液- 底物缓冲液：用于溶解底物的缓冲液- 停止液：用于停止反应的液体- 正负对照样品- 试剂盒说明书2. 仪器：- 微孔板读数仪- 洗板机或多道洗涤器- 离心机- 定量移液器和吸头- 恒温培养箱或恒温水浴三、实验步骤1. 准备工作：- 将所有试剂和样品从冰箱中取出，并等温至室温。
- 根据试剂盒说明书，准备所需的稀释液和缓冲液。
- 预热微孔板读数仪至所需的波长。
2. 样品和试剂的加入：- 将96孔微孔板的标签面朝上，用定量移液器向每个孔中加入50μL的样品或稀释液。
- 加入正负对照样品，作为比较和验证实验结果的参考。
3. 孔洗涤：- 将洗涤缓冲液加入洗板机或多道洗涤器的洗涤槽中。
- 将微孔板放入洗涤器中，按照设备说明进行洗涤，一般为洗涤3-5次。
4. 底物加入：- 将底物缓冲液加入每个孔中，使其完全覆盖样品。
- 在避光条件下，将微孔板放置在恒温培养箱或恒温水浴中孵育一定时间，通常为15-30分钟。
5. 反应停止：- 加入适量的停止液到每个孔中，停止底物的反应。
- 轻轻摇晃微孔板，使停止液均匀混合。
6. 测量吸光度：- 将微孔板放入预热好的微孔板读数仪中。
- 选择所需的波长，并记录吸光度值。
四、数据分析1. 样品浓度计算：- 使用正负对照样品的吸光度值作为参考，根据试剂盒说明书中的标准曲线，计算样品的浓度。
2. 数据处理：- 根据实验设计和目的，进行数据的统计分析和图形展示。
- 使用适当的统计学方法，如t检验或方差分析，对实验结果进行验证和比较。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物质（如蛋白质、抗原或抗体）的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括实验前的准备工作、试剂和设备的准备、样品处理、操作步骤和结果分析等内容。
二、实验前准备1. 实验室环境：确保实验室环境整洁、无尘、无污染，并保持适宜的温度和湿度。
2. 试剂准备：根据实验需求准备好所需的试剂，包括酶标板、抗体、酶标记物、洗涤缓冲液、底物等。
确保试剂的保存条件和有效期限。
3. 设备准备：检查和准备好所需的实验设备，包括酶标仪、洗板机、离心机等，并校准仪器的参数。
三、样品处理1. 样品收集：根据实验需求，收集所需的样品，如血清、尿液、细胞上清等。
确保样品的采集方法和保存条件符合要求。
2. 样品预处理：根据样品的性质和实验要求，进行必要的预处理步骤，如离心、稀释、加热等。
四、操作步骤1. 酶标板涂覆：将需要检测的抗原或抗体溶液加入酶标板孔中，使其吸附于孔壁。
孔数和样品处理方式根据实验设计确定。
2. 洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤酶标板孔，去除未结合的物质，避免非特异性反应的干扰。
3. 样品加入：将处理好的样品加入酶标板孔中，与酶标板上的抗原或抗体发生特异性结合反应。
4. 洗涤步骤：重复第2步的洗涤步骤，去除未结合的样品。
5. 酶标记物加入：加入与样品中特异性结合的酶标记物，形成免疫复合物。
6. 洗涤步骤：再次洗涤酶标板孔，去除未结合的酶标记物。
7. 底物加入：加入底物，使酶标记物催化反应产生可测量的信号。
8. 反应停止：加入适当的反应停止液，终止酶反应。
9. 测量信号：使用酶标仪测量酶标板上的信号强度，根据标准曲线或计算公式计算出样品中目标物质的浓度。
五、结果分析根据实验结果，可以得出样品中目标物质的存在与否以及其浓度。
根据实验设计和目的，进行数据统计和分析，并绘制相应的图表或曲线，以便进行结果的展示和解读。
ELISA样本准备及实验步骤
ELISA的标本准备在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。
对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用。
对于隔天再检测的标本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，最好-70℃冻存备用。
标本应避免反复冻融。
液体类标本包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。
血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
尿液：用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照此实行。
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
培养细胞检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
组织标本切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
ELISA实验步骤工作原理（以VEGF ELISA Kit为例）血管内皮细胞生长因子（VEGF）是最重要的血管生长因子之一。
二个亚单位由二硫键连接，组成分子量46-48KDa的糖蛋白质。
ELISA步骤、试剂及注意事项
ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05M PH9。
牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。
1ml,4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
（简称洗涤，下同)。
2.加样:加一定稀释的待检样品0。
1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。
1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。
1ml,37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。
1倍，即为阳性.方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。
1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。
1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
试剂器材1.试剂（1）包被缓冲液（PH9。
6 0。
05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克NaHCO32。
93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液(PH7。
4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8。
ELISA操作流程
前期准备工作：实验前样本和试剂盒室温平行1小时，如果样本是冻存样本，应提前拿到2-8摄氏度进行解冻（不建议直接室温解冻）准备好实验所需耗材，蒸馏水（去离子水）。
操作流程描叙：1，将要进行实验的版孔进行设定好，标准品5个点，每个点设定平行，需要用到10个孔，空白只需1个孔。
剩下孔可以做为样本孔2，稀释标准，准备好5个EP管，然后在每个EP管中加入150微升标准稀释液，编上编码，分别为1，2，3，4,5，在1号管中加入150标准品，用枪头反复吹打10次左右（注意控制幅度不要过大容易产生气泡）如果有涡旋仪可以在涡旋仪上涡旋5秒左右，然后换枪头，在1号管中取150微升加入到2号管，后面过程一次类推。
最后稀释完，前面4个管中每管液体在150微升，5号管为300微升。
浓度是从大到小。
3，标准、样本、空白加样：标准是每个浓度点2个孔（做平行），每孔加入50微升，加样过程中注意换枪头，样本孔中每孔加入50微升，加样过程中注意换枪头，空白孔加入50微升蒸馏水。
特别要说明的是，标准加样和样本加样尽量控制在15分钟内加完，如果时间拖的太长，会导致前面孔先反应后面孔才开始反应，这样数值偏差过大。
加完样后盖上封板膜，至37摄氏度孵育30分钟.4，洗版，在孵育过程中可以将洗涤液配好，20ml30倍浓缩洗涤液用蒸馏水或者去离子水定容到600ml即可。
每孔加入250-300微升的洗涤液（不要漫过版孔），（如果有震荡仪的话，可以讲板子放入震荡仪上5秒左右，然后静止三十秒，没有请忽略次过程）将板子在桌子上晃动5秒左右，然后静置30秒，甩干，拍板。
说明：甩干过程尽量要快，1秒内就可以完成，不要慢慢倾斜倒掉液体，直接翻板甩掉液体即可。
拍板过程需要在桌子上垫一层吸水纸或者滤纸，版孔朝下拍几下，拍干区别主要看吸水纸和滤纸上没有明显的水渍为完成。
5，每孔加入50微升的酶标试剂，此处在空白孔中不需要加（空白孔为空），孵育30分钟。
6，洗版同步骤47，显色，先每孔中加入50微升的显色A液，然后每孔中加入50微升显色B液。
ELISA操作规程
ELISA操作规程
标题：ELISA操作规程
引言概述：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测特定蛋白质、抗体或其他生物分子的存在和浓度。
正确的操作规程对于获得准确可靠的实验结果至关重要。
一、实验前准备
1.1 准备实验室基本设备：ELISA板阅读器、洗板机、移液器等。
1.2 准备实验试剂：包括底物、酶标记的抗体、洗涤缓冲液等。
1.3 根据实验方案准备样本：如血清、细胞上清液等。
二、板涂覆
2.1 将试剂均匀涂覆在ELISA板上。
2.2 封闭未被试剂覆盖的部分，防止非特异性结合。
2.3 将板在4℃下保存一段时间，促使试剂充分吸附。
三、样本加样
3.1 样本需按照实验方案稀释，避免过高或过低浓度。
3.2 每孔加样量要准确，避免交叉污染。
3.3 混匀样本后，避免气泡产生。
四、洗板
4.1 使用洗板机进行洗板，确保每孔洗涤充分。
4.2 每次洗板后用吸头吸去残留液，避免残留物干扰实验结果。
4.3 洗板缓冲液的配制与使用要按照规定比例和方法进行。
五、显色和读板
5.1 加入底物后，保持暗处孵育一段时间。
5.2 在适当波长下读板，记录吸光值。
5.3 根据实验方案计算样本浓度，注意结果的解读和分析。
结语：ELISA操作规程的正确执行对于实验结果的准确性至关重要。
只有严格按照规程操作，才能获得可靠的实验数据，为科研工作提供有力支持。
希望本文提供的ELISA操作规程能够对您的实验工作有所帮助。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，配制适当的缓冲液，例如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三倍磷酸盐缓冲液-Tween 20缓冲液）等。
2. 酶标板涂层抗体的制备：将特定抗体稀释至适当浓度，加入涂层液中，进行孵育。
三、样品处理1. 样品收集：收集待测样品，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据实验要求，对样品进行适当的处理，如稀释、离心等。
四、板涂覆1. 涂层液加入：将酶标板中的孔加入涂层液，注意避免气泡的产生。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使抗体与孔壁结合。
五、孵育1. 样品加入：将经过处理的样品加入酶标板的孔中。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使待测物与抗体结合。
六、洗涤1. 洗涤液准备：配制适当的洗涤液，如TBST。
2. 洗涤：将洗涤液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除未结合的物质。
七、检测1. 二抗加入：将特定的二抗加入酶标板的孔中，与待测物结合。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使二抗与待测物结合。
3. 洗涤：使用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的二抗。
4. 底物加入：将底物加入酶标板孔中，使酶与底物反应产生可测量的信号。
5. 反应停止：加入适当的反应停止液，停止底物反应。
八、数据分析1. 读板：使用酶标仪读取各孔的吸光度值。
2. 数据处理：根据实验设计和标准曲线，计算出待测物的浓度或相对含量。
3. 统计分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差、相关性等。
九、结果解读根据数据分析的结果，结合实验目的和背景知识，解读实验结果，得出相应的结论。
十、结论根据ELISA操作规程的步骤和结果解读，得出实验的结论，并讨论实验的可靠性和局限性。
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博士德ELISA试剂盒一般操作流程
点击次数：744 作者：博士德发表于：2009-03-26 16:03转载请注明来自丁香园
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。
试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。
每次检测都应该做标准曲线。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。
总数=样品数+9；做双份检测时×2。
其余重包装好放如冰箱中。
2. 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1 ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。
对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。
3. 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。
不洗。
5. 将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。
（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。
此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical dens ity）记录。
通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）
有两种设定空白对照的方案：
（1）将TMB空白显色孔设为对照。
所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
（2）将零孔设为对照。
得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
12. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。
应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。