小鼠胰岛素(Insulin) Elisa试剂盒使用说明

小鼠胰岛素(Insulin)Elisa试剂盒使用说明

货号：BC1710

保存：试剂盒保存：2-8℃，有效期6个月。

产品内容：

序号名称96孔配置

1酶标包被板96孔*1可拆卸板

2酶标试剂6ml*1瓶

3标准品(浓度16mIU/L)0.6ml*1瓶

4标准品稀释液2ml*1瓶

5生物素标记的抗Insulin抗体 1.5ml*1瓶

6显色剂A液6ml*1瓶

7显色剂B液6ml*1瓶

8终止液6ml*1瓶

9浓缩洗涤液（*30）20ml*1瓶

10封板膜1张

11使用说明书1份

产品说明：

小鼠胰岛素(Insulin)Elisa试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中小鼠胰岛素(Insulin)的含量。

采用双抗体夹心法测定小鼠胰岛素(Insulin)水平。用纯化的小鼠胰岛素(Insulin)抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入HRP标记的胰岛素(Insulin)抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素(Insulin)含量呈正相关。采用酶标仪在450nm波长测定吸光度（OD值），根据标准曲线，计算测试样品中胰岛素(Insulin)浓度。

实验材料与试剂配制：

1.仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，

滤纸。

2.洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。

样品收集、处理及保存：

1.细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以

1000×g离心15分钟，收集上清。

2.细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml左右，通过反复冻融，使

细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。

3.血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。

4.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20分钟后，

以1000×g离心15分钟，收集上清。

5.体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000

×g离心15分钟，收集上清。

6.组织标本：切取组织标本，称取重量0.05g，加入500ul的PBS，用手工或匀浆器，或超

声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000rmp离心20分钟，收集上清进行检测。

7.样品中不能含有NaN3，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

8.保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70℃保存，避免反复冷冻。保存过程中

如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤：

1.取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。

2.分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余

的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。标准品的

稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管中，充分混匀；

再在该试管中取100ul加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0号标准品。

稀释后各管浓度分别是：8.0mIU/L，4.0mIU/L，2.0mIU/L，1.0mIU/L，0.5mIU/L，0mIU/L。

注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。

3.加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入

50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗Insulin抗体10ul。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

6.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

7.温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

8.洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底

拍干。

9.显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

10.终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。

11.读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的30分钟内，以免影响准确性。

数据计算：

1.绘制标准曲线：各标准品OD值减去底色即减去空白孔OD

值，以6个标准品的OD值为纵坐标y，以标准品的浓度为

横坐标x，绘制曲线图，如图示，并计算出回归方程y=ax+b。

2.将待测样品的OD值代入方程式，计算各组样品浓度，再

乘以稀释倍数，即为样品的实际Insulin浓度。

3.敏感度：0.01mIU/L

注意事项：

1.实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。

2.加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与最后一孔间的时间间隔过大，否则将会

导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。

3.孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

4.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加

入终止液终止反应。

5.建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应

的稀释倍数。

6.建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒

有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。

安全性：

1．避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。

3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。