RT-PCR如何取大鼠脑组织

RT-PCR步骤

RT-PCR实验步骤佚名一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g 4℃ 5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心<12,000g 4℃ 10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心<12,000g 4℃ 5分钟弃去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震荡11.离心<7,500g 4℃ 5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟1.65℃ 15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时1.37℃ 1.5小时2.94℃ 5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步40个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝ 5V）。

RT-PCR实验方法大全(抽提RNA,RT,PCR)-3

RT-PCR实验方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-34. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RN A酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Pol y(A)尾巴。

绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的 Poly （A）尾，通常用Poly（A+）表示。

这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR，按常规。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。

如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

大鼠灌注固定取脑

大鼠灌注固定取脑大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。

小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。

时,剪开右心耳,使血液排出。

观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。

固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项：1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。

首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

脑组织采集操作流程

脑组织采集操作流程概述本文档旨在提供脑组织采集的操作流程，确保实验的顺利进行。

准备工作1. 确保实验室环境整洁、无菌。

2. 准备好以下工具和材料：- 手套- 外科刀具- 确保脑组织完整的冰冻- 乙醚或异氟醚的麻醉药物操作步骤1. 麻醉动物：- 将动物置于适当的麻醉设备中。

- 使用乙醚或异氟醚等麻醉药物使动物失去知觉。

2. 杀死动物：- 确保动物已经完全麻醉。

- 使用合适的方式将动物安全地杀死。

3. 切割头皮：- 用外科刀具将动物的头部皮肤切开，暴露出颅骨。

4. 打开颅骨：- 使用外科刀具小心地在颅骨上切开一个小孔。

- 用鹦鹉嘴钳将颅骨完全开放，暴露出脑组织。

5. 采集脑组织：- 使用手套小心地将脑组织取出，并放入冰冻中。

- 确保脑组织完整，并尽量避免污染。

6. 处理采集的脑组织：- 将采集的脑组织储存到合适的中，确保冷冻保存。

- 根据后续实验的需求，可以进行进一步处理，如切片等。

清理工作1. 将使用过的刀具和其他工具进行高温高压灭菌处理。

2. 清理实验室环境，保持整洁和无菌。

注意事项：- 在进行脑组织采集实验前，需要得到合适的伦理审批，并遵守相关的法律法规。

- 操作过程中要保证自身和他人的安全，注意使用麻醉药物时的剂量和注意事项。

- 在进行切割和操作时，要小心谨慎，避免对动物和人员造成伤害。

- 采集和处理脑组织时要保持无菌条件，避免可能的污染。

以上为脑组织采集的操作流程，希望能对您有所帮助。

小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作

小鼠PCR基因鉴定一、取材：小鼠出生后3-4周，给小鼠打耳标，并依照雌雄分笼饲养，需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘，放置好在印管中，并做好相应的标志，放置标本与标志混乱。

处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中，在98℃孔板中煮1小时（2）取出印管后，再加入B液75 μl二、扩增1.反应体系 Mix 5μlH20 3μlPrimer1 0.5mlPrimer2 0.5ml2.加样先计算出所需总量，加入印管中，混合均匀，离心，摆放好单个PCR管，将上述混合液放入PCR仪，每管9 μl盖紧。

3.扩增打开PCR仪并设置好程序，将PCR管放入PCR仪，扩增，40多分钟可以完成。

4.保存扩增后，取出PCR管，放入冰中保存。

三、琼脂糖凝胶电泳1.制胶：电子天平称取计算后的琼脂糖，小心倒入干净的锥形瓶内（锥形瓶内保持干净）。

加入TAE缓冲液，盖上锡箔纸，加热。

取制胶模具、梳子，安装固定，保证不会漏胶。

戴上手套，取出锥形瓶，掀开锡箔纸，冷却3-4分钟，加入染色剂，贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液，若有气泡。

室温放置凝固。

2.上样：胶凝固后，双手缓慢垂直地拔出梳子，避免破坏梳孔。

将胶板放上电泳槽，注意正负极变化，加入1×TAE缓冲液，从胶表面开始缓慢倒入，自然流向两边，然后依次对孔加入对应的DNA样品，剩余样品放入冰箱储存。

3.电泳：合上电泳槽，正负极对好，检查底部是否有气泡升起。

有气泡则电泳开始。

4.成像：观察是否出现条带，若出现条带，则停止电泳，打开凝胶成像系统，对结果进行比对、记录并拍照。

关闭系统，登记实验记录，取出胶并清洗仪器器材。

鼠灌注取脑1、麻醉：根据鼠的体型、重量适量注射麻醉剂，腹腔注射，用手套防止被鼠抓伤，虎口卡住颈部肌肉及其周围肌肉，注射药物时反推针筒活塞以防有空气，针头针刺入鼠腹腔注射药物后，并放回笼中，等待药物起效。

2、开胸：找到剑突，用弯剪在剑突附近把毛剪干净，露出表层皮肤，再沿肋弓朝两边剪开，注意深度，别剪到心脏，待心脏暴露出后，仔细剔除神经，剪掉心包膜，用镊子夹持剑突并将其连胸廓上翻固定，使心脏充分暴露。

RT-PCR操作步骤

RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

RT-PCR的操作方法(终极版)

qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。

2. 相关试剂盒（给出货号）等。

3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。

二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。

女生需将长发扎起。

2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。

3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。

三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。

样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。

1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。

a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。

直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。

用移液器吹打混匀。

TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。

b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。

每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。

用移液器吹打混匀。

收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。

RT-PCR

RT-PCR
一、动物组织提取总RNA
1.将取组织的器械和提取RNA使用的枪头、EP管、研钵等都用DEPC
水泡过夜，然后高温高压消毒（研钵要用锡箔纸包好），取组织及提RNA的房间紫外线消毒，枪、镊子等所用器材都紫外线消毒半小时以上
2.将所需组织取出后，用DEPC水冲洗，立即放入冻存管中，然后
放入液氮中保存
3.将凝固成块的组织取出后称量，倒入研钵中，再倒入少许液氮，
仔细研磨至细粉状，按100mg组织加入1000ul的TRIzol Reagent （以下简称Tz），加入Tz，再仔细研磨，使组织与Tz充分接触混匀，（在整个研磨过程中，一旦研钵中液氮蒸发完后，要再倒入液氮，保证整个过程都在液氮中进行）静置在室温下，直到固体变为液体（介于水与糊糊状之间就可）
4.将研钵中的液体充分吸出加入EP管中，按100mg组织加入200ul
氯仿计算加入氯仿，震荡机或剧烈摇晃EP管15s，使两者充分混匀（这时会看到Tz颜色变淡），在冰上静置5min
5.离心12000r 4℃15min
6.小心取出后放置冰上，将上清液吸入另一EP中，加入等体积异丙
醇（吸出多少上清液就加多少），剧烈摇晃15s，冰上静置5min
7.离心12000r 4℃15min
8.弃去上清液，EP管中会剩余白色透明状固体置于管壁上，这即是
RNA
9.加入25%的酒精500ul。

RT-PCR常用试剂及操作方法_百替生物

先配制 0.5mol/L，PH8.0 的 EDTA 溶液：将 37.2g EDTA-Na 加入 160ml 蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用 NaOH 调节溶液 PH 值至 8.0（约需 4gNaOH）。用蒸馏水定容至 200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制 50×TAE 溶液：在 400ml 蒸馏水中溶解 121g Tris 碱，加入 28.55ml 冰乙酸和 50ml 0.5ml/L EDTA 溶液，再加蒸馏水定容至 500ml，室温保存。（2）琼脂糖溶液（1.0％）：
在 20ml 水中加入 0.2g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为 6×Loading Buffer
二，电泳鉴定时注意事项：
佩戴一次性手套，避免皮肤接触 EB。无论做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。
将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水）37℃过夜，然后送至高压 3 次，后在 80℃烘烤箱中烘干（或置于 37℃中 8 小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备：（1）DEPC 水：泡实验器具的 DEPC 水的配制：1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。
三，电泳步骤
1， 50×TAE 取 10ml 稀释成 500ml，取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖。电炉上煮沸后加入 EB 5ul。另外 450ml TAE 倒入电泳槽中。 2，用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。 3，加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE 混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR 样品：5ul 样品 DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 4，接上电源，电压 120V，电流 50mA 进行电泳。 5，电泳约 1 小时后，紫外灯检测或凝胶成像仪成象并保存结果。

RTPCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。

(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

大白鼠取脑组织、小白鼠取脑组织

大白鼠（小白鼠）取脑组织
高恺陶（哈雷慧心）原创作品
材料准备；大剪刀、小剪刀、弯镊子、盛装容器（滤纸、培养皿、托盘、烧杯等）实验步骤：
1.剪开头颅：白鼠趴着竖向放置，先用大剪刀将颈部毛皮横向剪开，露出头骨底端，在头骨下方一点点处剪开颈部，从而用大剪刀可将头部剪下。

（具体看图1）（高恺陶原创作品）
2.露出头骨：沿着两耳两眼中间竖向剪开毛皮，此时将毛皮拨至两边（可以露出整个头盖骨即可），此时头骨下方颈部肉可以剔除一些。

（具体看图2.1、2.2）（哈雷慧心原创作品）
3.开颅（重要）：此时用大剪刀在头骨中线处划线，深划两次后，再控制力度来回划，至头骨划破（没划破也没有太大问题）（划太重可能会伤及脑组织，太轻则下面的步骤不方便操作）此时用大剪刀（小剪刀）将头骨从中间向两边撬开（贴着头骨撬），并适当将中下方骨头向两侧压。

（具体看图3.1、3.2）（高恺陶原创作品）
4.去除脑膜：此时脑在眼前了，用镊子和剪刀寻找脑表面的膜，并且将其小心剪破，，直至脑表面无拉伸状即可。

（上一步的骨头向两边撬开，如果此时有膜牵引，可以随即将膜剪破）（高恺陶原创作品）
5.开脑顶端：用镊子在脑上部——两侧（竖着）以及上方（平着）来回划动（两侧贴近骨头，上方平着划动）。

此时用小剪刀剪断上册扇形骨头的两端，并用剪刀撬开。

（具体看图5）（哈雷慧心原创作品）
6.抽丝剥茧：拿起头，竖起来，用镊子沿着脑左、右以及上端开始剥离连接点（上端有两个，中心位置有两个细的雪白的连接点，中下方有两个粗的雪白的连接点）至此，脑可以自然而然的剥离出来。

（具体看图 6.1、6.2）（高恺陶原创作品）。

RT-PCR实验方法

RT-PCR 实验方法TRIzol法抽提总RNA细胞1×107↓加1mlTRIzol↓用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块颠倒混匀10下，室温5分钟↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓4℃，离心12000g，15分钟↓转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中↓加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟↓4℃，离心12000g，10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml↓4℃离心7500g，5分钟↓弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至20μl逆转录反应：RNA 10μlOligo(dT)15 1μl混匀，离心，70℃5min立即冰水浴，稍离心然后按照下表配置反应体系总体积20μl↓混匀，离心，42℃60min↓95℃10min（破坏MLV）↓4℃保存大鼠bcl-2:共711bp.1、PCR实验：配置反应体系：10×buffer 5ul25mmol/LMgCL2 2ul15mmol/LDNTP 2ul引物R 2ul引物F 2ulTaq酶1ulCDNA 2ul去离子水34ul反应条件：1、94℃4min2、94℃30s3、57℃30s4、72℃2min30s5、goto2，35循环6、72℃10min7、4℃保存。

用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

大鼠bax:共579bp.配置反应体系：10×buffer 5ul25mmol/LMgCL2 2ul15mmol/LDNTP 2ul引物R 2ul引物F 2ulTaq酶1ulCDNA 2ul去离子水34ul反应条件：1、94℃4min2、94℃30s3、59℃30s4、72℃2min5、goto2，35循环6、72℃10min7、4℃保存。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

内参反应：10×buffer 5ul25mmol/LMgCL2 2ul15mmol/LDNTP 2ul引物R 2ul引物F 2ulTaq酶1ulCDNA 2ul去离子水34ul反应条件：1、94℃4min2、94℃30s3、54℃30s4、72℃1min5、goto2，30循环6、72℃10min7、4℃保存。

描述大鼠剥取脑组织的步骤操作要点,注意事项

描述大鼠剥取脑组织的步骤操作要点,注意事项大鼠剥取脑组织是一项非常重要的实验操作，需要严格按照步骤进行，以保证实验结果的准确性。

下面是描述大鼠剥取脑组织的步骤操作要点和注意事项：
步骤操作要点：
1. 麻醉大鼠：使用适当的麻醉剂将大鼠麻醉，注意麻醉剂的剂量和作用时间，以免对实验结果产生影响。

2. 体表消毒：在开始操作之前，对大鼠的手术部位进行消毒，以避免感染。

3. 穿刺颅骨：使用适当的工具在大鼠头部穿刺颅骨，以便进行脑组织的剥离。

4. 剥离脑组织：使用适当的工具将脑组织分离出来，注意不要损伤脑组织，以保证实验结果的准确性。

5. 存储脑组织：在完成剥离后，将脑组织存储在适当的容器中，以便进行后续实验操作。

注意事项：
1. 需要遵守实验室安全规定，穿戴适当的个人防护用品，如手套、口罩等。

2. 在操作过程中，需要保持手术部位的清洁，并注意避免感染。

3. 在麻醉大鼠时，需要根据大鼠的体重和生理状态确定适当的麻醉剂剂量，并在麻醉过程中监测大鼠的生命体征，如呼吸、心率等。

4. 在剥离脑组织时，需要使用适当的工具，并注意不要损伤脑
组织。

5. 在存储脑组织时，需要选择适当的容器，并注意储存条件，如温度、湿度等。

rt-pcr试验步骤

rt-pcr试验步骤总RNA提取：1．用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg 组织加1ml的裂解液RL后匀浆。

组织样品容积不能超过RL容积的10%。

2．将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3．每1mlRL加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

4．于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。

水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

5．加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。

得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。

6．10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

7．加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。

8．加500μl 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。

9．加入700μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。

加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。

将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。

10．取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。

如有DNA污染，请用DNAase消化。

cDNA合成：1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：模板RNA：总RNA 2μg引物：Oligo(dT)18 (0.5μg/μl) 1μl无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11μl。

一步法RT-PCR检测大鼠死后脑HGPRT mRNA的降解

ｆｏｉｔｉｒｖｒｅｔａｓｒｔｓ — ｏｙｒｓｈｉｅｃｉｎ（ｌｒｕｍｅｒｃｅｅｓｒｎｃｉａｅｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｐｏＲＴ— ＣＲ）Ｐ．Ｒｅｕｔ：ｅａｌｉａｉｎｐｏｕｔｎｏｓｌｓＴｈｍｐｉｃｔｒｄｃｉｆｆｏｏ
产物呈下降趋势。结论：步法ＲＰＲ技术检测大鼠脑组织ＨＧＰＴｍＲＮＡ，死后的降解呈一Ｔ— ＣＲ在现出一定的规律性，为Ｐ可ＭＩ断提供一种新的指标。推
主题词死亡／断次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶／谢逆转录一合酶联反应诊代聚
（ｈｙｎ４２０）ＺｕＦｎｃｅｇＳｉａ４００ｈａｇｈｎＬｉｅａｃｅｇＨｕｉｈｎ
ＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｅｔｅＴｏｅｐｏｅｔｅｒｌｔｏｓｉｅｗｅｎｐｓｍｏｔｍｎｅｖｌＰＩａｄｔｍｅｊｃｉ：ｘｌｒｈｅａｉｎｈｐｂｔｅｏｔｒｅｉｔｒａ（Ｍ）ｎｉ — ｖ
Ｃｏｃｕｉｎ：ｍｅｄｐｎｅｔｄｇａａｉｎｏｎｌｓｏＴｉ — ｅｅｄｎｅｒｄｔｆＨＧＰｏＲＴｍＲＮＡｎｂａｎｄｔｃｅｙｏｅｓｅｌｏｉｔｉＲＴ— ＣＲｉｒｉｅｅｔｄｂｎ — ｔｐｆｒｍｅｒｃｕＰ
Ｒｅｒｅｔａｓｒｐａｅｐｙｍｅａｅｃａｎｒａｔｏｎｖｅｓｒｎｃｉｔｓ — ｏｌｒｓｈｉｅｃｉＡｎｉａ，ｂｏａｏｙｍｌＬａｒｔｒＲａｔｓ

组织RT-PCR注意事项

1.抽提RNA都是为了得到其mRNA，而mRNA和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。

而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。

2.提取RNA前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。

研磨要充分，使组织块变小。

3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。

4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。

操作速度要快，冰上进行。

我做过大鼠下丘脑组织的RT-PCR，在动物房将组织取好先放在RNa－free的EP管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－70°冰箱内，在抽RNA的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善RNA抽提的质量。

用生理盐水或PBS冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提RNA的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），－80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。

如果试剂盒没到，那就直接放在EP管中，提RNA的时候再拿出来再加也可以。

就是组织可能会不容易撵碎一些。

我觉得你可以用高压过的EDPC处理的水进行清洗（2－3次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与RNA提取方法相关，我用的是TRNZOL法，一般取50－100mg，）于EP管中，直接放到－80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。

5.直接原组织冻存。

本实验室做过人子宫内膜FGF基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。

一步法RT-PCR检测大鼠死后脑HGPRT mRNA的降解

一步法RT-PCR检测大鼠死后脑HGPRT mRNA的降解朱方成;雷怀成
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2009(038)001
【摘要】目的:探讨大鼠死后不同时间次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)mRNA的降解情况与死亡时间(PMI)的关系.方法:将36只大鼠断颈处死后置于20℃温度控制系统内,利用一步法荧光标记RT-PCR技术检测大鼠脑管家基因HGPRT mRNA在死后即刻至8d的相对表达量的变化.结果:在死后即刻至7d 大鼠脑组织均可检测到HGPRT mRNA,其扩增产物呈下降趋势.结论:一步法RT-PCR技术检测大鼠脑组织HGPRT mRNA,在死后的降解呈现出一定的规律性,可为PMI推断提供一种新的指标.
【总页数】3页(P14-16)
【作者】朱方成;雷怀成
【作者单位】郧阳医学院法医学教研室,十堰,442000;郧阳医学院法医学教研室,十堰,442000
【正文语种】中文
【中图分类】R74
【相关文献】
1.实时RT-PCR检测大鼠死后管家基因mRNA的时序性降解 [J], 任广睦;刘季;王英元
2.一步法Real-time RT-PCR检测结直肠癌前哨淋巴结CK20 mRNA的表达 [J], 黄建华;张鑫;侯军民;荆晓岳;
3.一步法Real-time RT-PCR检测结直肠癌前哨淋巴结CK20 mRNA的表达 [J], 黄建华;张鑫;侯军民;荆晓岳
4.一步法实时荧光定量PCR检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1mRNA 的表达 [J], 于海英;孙中华;崔俊生;刘晓彬;倪劲松
5.大鼠肾HGPRT mRNA降解与死亡时间关系的研究 [J], 朱方成;雷怀成
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