细菌的染色检查法

作细菌染色检查，首先要制备细菌涂片。制备细菌涂片一般包括涂片、干燥、固定三步。1．涂片：取洁净玻片一张，按以下步骤操作

肉汤培养物涂片：

①右手拿接种环的黑色胶柄部分，左手托持试管。

②接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直至金属丝烧红(图1-3)，然后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌。

③用右手小指和手掌小鱼肌侧拔掉左手所持试管的棉塞，并立即火焰烧灼试管口灭菌。

④用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取出菌液(图1-4)。注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。

⑤再次灭菌试管口，将棉塞在火焰上略加烧灼（时间要短，以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。

⑥将接种环上之菌液涂于载玻片上，制成的菌膜直径约1cm左右。然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。液体标本（如脓液、痰液等）均可照此法涂片斜面培养物涂片：

用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先取一接种环无菌生理盐水置于载玻片上，然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上取少量菌苔，放入生理盐水内轻轻研匀，制成直径lcm左右的菌膜。

如有多个标本行同一方法染色时，可用蜡笔在玻片上划出数格，做好标记再分别进行涂片，以免混淆。

2、干燥：

涂片最好在室温中自然干燥，如需加速干燥，可将标本向上小心地放置离火焰半尺高处，略烘促使干燥，切不可在火焰上烧干。

3、固定：

常用加热固定法。涂片干燥后，让玻片有菌膜的面向上，在火焰的最热部分迅速通过三次。固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染料的通透性。

以上步骤完成后，便可进行各种染色。

（二）革兰（Gram）染色法

革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法，籍此染色法，可将所有细菌区分为两大类。【材料】金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)24h 斜面培养物、革兰染色液、生理盐水、载玻片、接种环等。

【方法】

1、初染：玻片菌膜上滴加结晶紫染液1～2滴，染色1分钟，用细流水冲冼剩留染液，甩去片上积水。

2、媒染：加卢戈碘液处理1分钟后细流水冲洗，甩去积水。

3、脱色：加95％酒精2～3滴，轻轻摇动玻片，使脱色均匀，一般处理约30秒左右，细流水冲洗，甩去积水。

4、复染：加稀释石炭酸复红液1～2滴，染30秒钟，细流水冲洗，待干或用滤纸吸干，油镜观察。

【结果】葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以G+表示；大肠杆菌染成红色，称革兰阴性，以G-表示。

【注意事项】

1、脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度，可使G+菌被误染为G-菌；脱色不够，则G-菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。

2、G+菌与G-菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH等的影响，只有严格正规操作，才能得到正确结果。

【附录】

1、与医学有关的常见细菌的革兰染色性：

2、革兰染色液的配制

（1）结晶紫染液

①结晶紫酒精饱和液：取14g结晶紫溶于100ml 95％的酒精内。

②１％草酸铵水溶液：草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水中。

③将已配好之①液20ml和②液80ml混合即成，置瓶中备用。

（2）芦戈（Lugol）氏碘液

①碘1g；碘化钾2g ；蒸馏水300ml

②先将碘化钾2g溶于100ml蒸馏水中，再加碘1g，用力摇匀待溶解后，加蒸馏水至300ml即成。供革兰染色媒染用。

（3）95％酒精

（4）石炭酸复红稀释液

①石炭酸复红染液：

取碱性复红酒精饱和液（95％酒精100毫升中加碱性复红10g）10ml，与5％石炭酸水溶液90ml混匀即成。

②稀释石炭酸复红染液：

将上述石炭酸复红染液用蒸馏水稀释10倍即成。

上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮存于棕色瓶内。