【精品课件】无菌检查法培训
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无菌检查法培训-PPT课件
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
Βιβλιοθήκη 菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保 存在2～8℃可在 24小时内使用。黑曲霉孢子 悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内 使用。 培养基接种 取每管装量为 12ml的硫乙醇酸 盐流体培养基 9支，分别接种小于100 cfu的金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌、生孢梭菌各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马 丁培养基5支,分别接种小于 100 cfu的白色念 珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养5天。逐日观察结果。 结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的 培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度 检查符合规定。
薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数量作阳性对 照用；若采用直接接种法，应增加供试品 1支（或 瓶）作阳性对照用。）
表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽 验样品的最少检验数量
无 菌 检 查 法
表3. 固体制剂最少检验量及上市抽 检样品的最少检验数
金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
无菌检查ppt课件
ISO 11737-2 2009 医疗设备的灭菌－微生物学方法 第二部分： 灭菌过程中无菌测试的定义，验证及维护
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4
三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
15
八、验证方法——薄膜过滤法
供试品稀释、 过滤 √ —— √ —— √ ——
√
菌株
金葡 金葡 大肠 大肠 生孢 生孢
枯草
菌量
培养基
组别
流乙醇酸盐流 体培养基
最后一次冲洗 液加菌＜ 100cfu/ml
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13
八、验证方法
目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。
无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。
医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已 转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选 用直接培养法。
3、培养基适用性检查
①无菌性检查——排出培养基本身的污染，避免无菌试验过程 中由培养基引起的假阳性
②灵敏度检查——确保培养基营养性良好，对微生物具有生长 促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引起的假阴性
注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。
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4
三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
15
八、验证方法——薄膜过滤法
供试品稀释、 过滤 √ —— √ —— √ ——
√
菌株
金葡 金葡 大肠 大肠 生孢 生孢
枯草
菌量
培养基
组别
流乙醇酸盐流 体培养基
最后一次冲洗 液加菌＜ 100cfu/ml
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八、验证方法
目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。
无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。
医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已 转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选 用直接培养法。
3、培养基适用性检查
①无菌性检查——排出培养基本身的污染，避免无菌试验过程 中由培养基引起的假阳性
②灵敏度检查——确保培养基营养性良好，对微生物具有生长 促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引起的假阴性
注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。
无菌检查法PPT
无菌检测过程
无菌检测过程
• 结果判断
阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 若供试品管均澄清， 或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何 一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试 验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件 时方可判试验结果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查 法的要求。 （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的 物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查， 若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符。
6.革兰氏---染色
• •
• •
第一步：结晶紫使菌体着上紫色 （染色1min后用水洗） 第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在 细胞内。 （染色1min后用水洗） 第三步：酒精脱色，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水 洗细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 第四步：番红复染3min，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌
染色结果
• 保持初染时深紫色的菌体，称为革兰氏染 色阳性菌（G + 菌） • 而能染红色的菌体称为革兰氏染色 阴性菌（G - 菌）。
2015 年 版 《 中国药典 》 无菌检 查法的重大修订
1 、实验环境的重大修订 2、培养基体系的重大修订 3 、一、二、三部药典附录的整合修订。（...）
无菌检查法的重大修订
细菌
真菌
霉菌：黑曲霉
4.细菌的结构
• 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核 质
医疗药品无菌检查法验证培训课件
医疗药品无菌检查法 验证
一、概述：
1.1 定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方 法。
2.1验证的必要性和意义：① 确认Biblioteka 采用的方法检查供试品无菌的适合性。
② 保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和 重现性；检查方法的完整性。
③ 与同药品无菌检查接轨。
① 确定抑菌作用（抑细菌、真菌试验验证），选择 敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验（阳性 菌回收试验）。
② 消除样品抑菌性的方法验证：
医疗药品无菌检查法验证
11
a) 化学钝化中和法（化学试剂中合法）：利用化学 （生物）专属性灭活，常用钝化剂有：对氨基苯 甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜过滤法和 直接接种法也可用。对化学中和剂不敏感的样品， 用酶中和，如β -内转氨酶。
医疗药品无菌检查法验证
3
三、无菌检查的试验要求:
3.1 环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌 操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。
3.2 人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。
3.3 设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求， 培养箱的温度指示装置要校验。
3.4 培养基：
3.4.1 按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序 灭菌。
3.5.3 依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。
医疗药品无菌检查法验证
6
四、无菌检查法验证:
4.1 原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液、 冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关规 定。
4.2 验证分类： ① 前验证：建立无菌检查方法时。 ② 再验证：修订检查方法时。 ③ 定期验证：供试品组合或原检查条件改变。
生长良好，培养基灵敏度符合要求。
一、概述：
1.1 定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方 法。
2.1验证的必要性和意义：① 确认Biblioteka 采用的方法检查供试品无菌的适合性。
② 保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和 重现性；检查方法的完整性。
③ 与同药品无菌检查接轨。
① 确定抑菌作用（抑细菌、真菌试验验证），选择 敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验（阳性 菌回收试验）。
② 消除样品抑菌性的方法验证：
医疗药品无菌检查法验证
11
a) 化学钝化中和法（化学试剂中合法）：利用化学 （生物）专属性灭活，常用钝化剂有：对氨基苯 甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜过滤法和 直接接种法也可用。对化学中和剂不敏感的样品， 用酶中和，如β -内转氨酶。
医疗药品无菌检查法验证
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三、无菌检查的试验要求:
3.1 环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌 操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。
3.2 人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。
3.3 设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求， 培养箱的温度指示装置要校验。
3.4 培养基：
3.4.1 按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序 灭菌。
3.5.3 依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。
医疗药品无菌检查法验证
6
四、无菌检查法验证:
4.1 原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液、 冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关规 定。
4.2 验证分类： ① 前验证：建立无菌检查方法时。 ② 再验证：修订检查方法时。 ③ 定期验证：供试品组合或原检查条件改变。
生长良好，培养基灵敏度符合要求。
无菌检查法课件
微生物的检测方法
01
02
03
04
培养法
通过培养基培养微生物，观察 其生长情况，进行检测。
显微镜检查
通过显微镜观察微生物的形态 、大小、染色等情况，进行检
测。
生物发光检测法
利用生物发光原理，检测微生 物的存在。
免疫学方法
利用抗原抗体反应，检测微生 物的存在。
03
无菌检查法的操作流程
样品采集
采样前准备
霉菌
常见的无菌检查对象，包 括酵母菌、霉菌等。
病毒
体积较小的微生物，需要 特殊的方法进行检测。
微生物的生长条件
营养物质
微生物生长需要各种营养 物质，如碳源、氮源、水 、无机盐等。
温度
不同微生物需要在不同的 温度下生长，一般温度范 围在20℃-45℃之间。
pH值
微生物生长的酸碱度条件 ，不同微生物适应的pH值 范围不同。
操作规范
严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
样本处理
对样本进行适当的处理，以去除杂菌并保留所需检测的微生物。
培养条件
确保培养基处于适宜的温度和湿度条件下，以促进微生物的生长。
观察记录
对实验过程进行详细记录，包括操作步骤、观察结果等。
实验后的处理
器具清洗
实验结束后，对使用过的器具进行彻底清洗 和消毒。
防止污染
在接种和培养过程中，应采取措施防 止培养基和培养物受到污染。
结果观察与判定
观察微生物生长情况
定期观察培养物的生长情况，记录生 长特征和菌落形态等信息。
菌落计数
结果判定
根据检验目的和标准要求，对观察到 的微生物生长情况进行判定，如是否 符合无菌要求或特定微生物的存在与 否。
无菌技术操作培训教材(PPT 31张)
无菌技术的基本操作方法
无菌持物钳的使用法
无菌持物钳是用来夹取和传递无菌物品的器械
持物钳的类别
三叉钳
三叉，呈 弧形向内 弯曲
卵圆钳
卵圆形 环
镊子
由于两环平行紧贴，不能持重物。用以夹取刀、
用以夹取盆、盒、瓶、罐等较重的物品。 剪、钳、镊、治疗碗及弯盘等。
用以夹取棉
无菌持物钳的使用法
方法一 ：消毒 液浸泡 1、经压力蒸汽灭菌后浸泡在内盛消毒液的大口有盖容器内 法
抓住 四个角
递无菌碗
无菌包使用法
无菌包使用注意事项
检查无菌包的有效期及质量，潮湿、破损时不可使
用。
打开无菌包时避免系带污染无菌区。 开包、关包时手不可触及包布内面、污染包内无菌 物品，不能跨越无菌区 。 无菌物品一次未使用完，关包时系带横向缠绕，表 示此包已打开过，且要准确注明开包日期及时间， 剩余物品可在24h内使用。
2、容器深度与钳长度比例适合
持物钳的存放
3、消毒液面浸没无菌持物钳轴节以上 2～3cm或镊子长度的1／2
4、每个容器只能放置一把无菌持物钳 ， 以免相互碰撞 5、容器及无菌持物钳应保持无菌，每周消毒、灭菌一次，同时更 换消毒液。手术室、门诊换药室、注射室等每日消毒、灭菌。
2-3
将盛有无菌持物钳的无菌干罐保 治疗前开包，4～8h更换一次
无菌罐
无菌容器的使用法
手托底部，手指 不能触及容器边 缘及内面
手持无菌容器
打开无菌容器
无菌容器的使用法
无菌容器注意事项
保持无菌容器盖的内面无菌，避免灰尘落入无菌容
器内。
用无菌持物钳取物时，钳及物品未触及容器边缘 用毕盖严容器盖，避免无菌容器内无菌物品在空气 中暴露过久
无菌检查ppt课件
ISO 11737-2 2009 医疗设备的灭菌－微生物学方法 第二部分： 灭菌过程中无菌测试的定义，验证及维护
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三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组
—— √
—— √
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枯草 白念 白念 黑曲霉 黑曲霉
胰酪大豆胨液 体培养基
阳性对照组 试验组
阳性对照组 试验组
阳性对照组
培养
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
16
八、验证方法——结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则 说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作 用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌 检査。
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18
十、日常无菌检查
准备间
无菌检查室
培养基、 供试品、 灭菌物 品的准
备
供试品接入培 养基
FTM+供:2管 TSB+供:1管 阴性:各1管 （FTM、TSB）
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阳性对照室
取其中一管 FTM+供，加入
1~100cfu 金黄色葡萄球
菌
准备间
FTM+阴:30~35℃ TSB+阴:20~25℃
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4
三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组
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枯草 白念 白念 黑曲霉 黑曲霉
胰酪大豆胨液 体培养基
阳性对照组 试验组
阳性对照组 试验组
阳性对照组
培养
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
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八、验证方法——结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则 说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作 用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌 检査。
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十、日常无菌检查
准备间
无菌检查室
培养基、 供试品、 灭菌物 品的准
备
供试品接入培 养基
FTM+供:2管 TSB+供:1管 阴性:各1管 （FTM、TSB）
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阳性对照室
取其中一管 FTM+供，加入
1~100cfu 金黄色葡萄球
菌
准备间
FTM+阴:30~35℃ TSB+阴:20~25℃
2019版无菌检查法PPT课件-PPT精品文档
1978年 欧洲药典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试
1988年 美国FDA规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再复试，这 一批次的药品应报废。实际上排除了药品无菌阳性后再测试的机会 2019年 英国药典2019无菌测试以一次检出为准，取消复试。 2000年 美国药典24版无菌测试以一次检出为准，取消复试。
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
4、将原排列第 6. 的 0.5%葡萄糖肉汤培 养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌 检查） 修订排列为第 4. ——按顺序归类培养基1.～4. 均为直接用 于无菌检查的液体培养基。
（三）培养基灵敏度检查部分
1、在菌液制备中，修订黑曲霉的孢子悬液 制备方法：规定应使用含0.05％（v/v） 聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗 脱孢子及稀释孢子液，制成每1ml中含孢 子数小于100 cfu的孢子悬液。 删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱 布能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子 悬液的操作方法
1990版 2019版 2000版
与85年版相同 开始要求对培养基进行灵敏度检查。 规定实验环境为100级洁净度；检验数量从2支/瓶增加为 6～11支/瓶；明确薄膜过滤法为首选方法包括大容量液体样品 首次引用、收载全封闭过滤技术。
对比国际无菌检查发展历史 ， 我 国2000版以前药典无菌检查法因技 术和认识的不足，对提高方法捡出 率、保证检验结果的准确性、可靠 性方面的规定与先进国家药典中的 要求严重脱节。
一、附录无菌检查法中的增、修订
（一）总则部分
（二）培养基部分 （三）灵敏度检查部分 （四）稀释液、冲洗液部分 （五）方法验证部分 （六）薄膜过滤法部分 （七）培养及观察部分 （八） 结果判断部分 （九） 表1、表2和表3
无菌检查法 ppt课件
FT接种金葡、铜绿、生 孢、枯草；改良马丁接 种白念和黑曲霉
2
2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 方法适用性检查
2015版
2010版
菌种：金葡、枯草、生 菌种：金葡、枯草、铜 孢、大肠埃希菌、白念、 绿、白念、黑曲霉 黑曲霉
2015版药典三部保留了生物制品无菌检查法的特点，如检验数量、 硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。 由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验也进行了修 订。
最少抽检数量 5个 10个 20个
2
无菌检查法（2010版）
• 供试品接种及培养基接种 • 薄膜过滤法
采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为 50mm，根据供试品及其容剂的特性选择滤膜材质。使用时应保证滤 膜在过滤前后的完整性。 • 水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜，油类供试品， 其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率， 应注意保持供试品溶液和冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品溶液经 薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗，每张滤膜每次冲洗量一般为 100mL，总冲洗量不得超过1000mL，以避免滤膜上的微生物受损伤。 • 水溶液供试品：取规定量，每支（瓶）供试品装量为5mL及以下者， 全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。 • 水溶液固体供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明 复溶，然后按水溶液供试品项下的方法操作。
• 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
2
无菌检查法（2010版）
• 所用到的培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基
• 培养基的适用性检查： 无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基应符合无菌性检查 和培养基灵敏度检查要求。本检查可在供试品无菌检查前或与供试品无 菌检查同时进行。