毒理学 急性皮肤毒性试验
揭秘化妆品安全性评价技术(三)——急性毒性评价试验和体外预测方法
揭
安全
＿
一一
急性毒 性评价 试验 和体 外预 测 方法
文 ／ 树军 程 焦 红
为 毒 性 终 点 的 经 典 试 验 ， 要 是 求 主 性 毒 性 是 化 妆 品安 全 性 评价 最 基 础 的试 验 ， 常 包括 经 曰和 经 皮 途 通 ， 径 ， 要 时 对 某 些 极 端 的 暴 露 途 径 （ 吸 入 ） 应 给 予 考 虑 。急 性 必 如 也 毒 性 的主 要 目的 是 观 察 化 学 物 急性 毒 性 效 应 、 量 一 应 关 系 、 器 官 病 剂 反 靶 变 及 其 可 逆 性 等 。自从１ ２ 年 Ｔｅ ａ 第一 次 引 入 了半 数 致 死 量 （ Ｄ ０ 的 ９ ７ ｒｖ ｎ Ｌ ５ ） 概 念 以来 ， Ｄ ０ 为 急 性 毒 性 的主 要 指 标 ， 是 ， 上世 纪 ７ 年代 开 始 ， Ｌ ５成 但 从 Ｏ Ｌ ５ 试 验 受 到 科 学 界 和 动 物 福 利 主 义 者 的广 泛 批 评 ， 后 ， 典 急 性毒 Ｄ ０ 此 经 性 试 验 方 案 经 过 了多次 改 进 。２ ０ 年 ， 典 的 经 口Ｌ ０ 验 被 废 除 ， ０ ２ 经 Ｄ５ 试 取 而 代 之 以３ 优 化 方 法。之 后 ， 性 吸 入 毒 性 的 试 验 方 法 也 进 行 了修 订 ， 项 急 并
用的。
化 妆 品 急 性 毒 性 试 验 一 般 选 用
（ Ｔ 方 法 ”， 原 理 类 似 于 经 口 Ａ Ｃ） 其
皮 肤 途 径 一次 接 触 或 ２ ｓ＼ 内多 次 ４ ］时 接 触 某 一 化 学 物 质 ， ／＼ 内 吸 入 或４ Ｊ时
暴 露 化 学 物 所 引起 的 不 良 效 应 。 “ 一 次 ”接 触 ， 经 口途 径 染 毒 时 ， 指 在 是 瞬 间 给 予 实 验 动 物 染 毒 ， 经 呼 吸 在 道 与 皮 肤 染 毒 时 ， 指 在 一 个 规 定 是
《动物毒理实验》课件：实验3 皮肤刺激性试验
皮肤刺激强度分级
皮肤局部反应
无刺激性 轻度刺激性
无异常改变 充血、红斑
中等刺激性
红斑，少量小出血点，水肿， 少量丘疹以及小水疱
强刺激性
红斑，皮下出血，水肿，有很 多小水疱并有可能合并成大水 疱，糜烂，表皮剥落，有溃疡 形成等
评分 0 <2
2~6
>6
方法评价
皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关， 也与试验过程中的质量控制相关。
经4~8h后，除去斑贴物，每24h观察一次各小区皮肤的局部 反应，连续观察4d，按皮肤刺激反应评分（表1），定量地 评定受试化学物对皮肤局部刺激作用的强度。红斑通过肉眼 观察，水肿通过轻轻触摸的方法来评分。
表1 皮肤刺激强度反应评分
皮肤反应强度
评分
无红斑
极轻微红斑（勉强可见）
1
A.红斑和 边界清晰的红斑（明显红斑，淡红至鲜红色） 2
本法与局部全封闭斑贴法不同之处在于： 1.每组的白色家兔数不应少于3只； 2.采用纱布作斑贴物，在无刺激作用的前提下，用半封
闭敷料固定； 3.斑贴不需要在擦伤皮肤上进行； 4.斑贴4h，然后去掉斑贴并清洗皮肤，观察0.5h、1h、
24h、48h和72h后的皮肤反应。 皮肤刺激反应评分同全封闭法。
结果分析
皮肤刺激试验又称皮肤原发性刺激试验。
试验目的
了解受试化学物对皮肤的直接刺激作 用以及刺激强度。
试验材料——实验动物
实验动物：成年白色家兔或白色豚鼠， 首选白色家兔。
在皮肤刺激试验中，动物品种的选择 很重要。目前多选用兔和豚鼠，对于 强刺激或无刺激作用的化学物选用家 兔检测效果好，但对作用缓和的刺激 性化学物，选用豚鼠所获得的试验结 果较准确。
毒理学——4
24
3．经皮肤染毒 脱毛：化学法脱毛或机械法脱毛 （体表面积的10%）。 染毒：局部涂敷受试物或大鼠、 小鼠浸尾法染毒。
25
4．经注射途径染毒
静脉注射或滴注；
腹腔注射； 肌肉注射； 皮下注射； 皮内注射； 椎管内注射
究和将研究结果外推到人提供依据。
58
（三）亚慢性毒性试验方法的要点
1. 实验动物的选择
(1) 物种和品系 实验动物对受试物的生物转化、生理生 化、毒性反应与人类相当或相似。
两种实验动物，啮齿类和非啮齿类。
59
(2) 性别、年龄和动物数 两种性别，每组雌雄各半；
13
适宜容积染毒
① 经口：20ml/kg(空腹动物)； ② 经皮：2ml/kg； ③ 静脉：1ml/kg(5min以上)； ④ 肌肉注射：0.5ml/kg(一个部位)； ⑤ 眼睛：0.01ml/每眼； ⑥ 直肠：0.5ml/kg； ⑦ 阴道：大鼠0.2ml，兔lml； ⑧ 吸入：2mg/L； ⑨ 鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。
吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌 后部，迫使动物咽下。 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供 实验动物自行摄入。
18
2．经呼吸道染毒 吸入染毒 静式吸入染毒；
动式吸入染毒。
气管内注入
19
静式吸入染毒 方法：将实验动物置于有一定体积的密 闭容器中，加入液态或气态受试物，形成 一定浓度的受试物空气环境进行染毒。 优点：简单、方便、受试物消耗少，适 合于小鼠。 缺点：氧气减少；浓度不稳定；经皮吸 收；不适合稍大动物；挥发性。
毒理学资料
毒理学资料解释毒理学资料包括化学毒物的急性毒性、刺激性、亚急性和慢性毒性、致突变性、生殖毒性及致癌性。
急性毒性选用的急性毒性指标为半数致死剂量或浓度 ( LD50 或 LC50)，即引起受试动物（大鼠rat小鼠mouse）半数死亡的剂量或浓度。
指使实验动物一次染毒后，在14天内有半数实验动物死亡所使用的毒物计量。
LD为Lethal dose(致死剂量)的缩写，标志数值：经口摄：固体LD50≤500mg/kg，液体LD50≤2000mg/kg；经皮肤接触24h，LD50≤1000m g/kg；吸入粉尘、烟雾及蒸气半数致死浓度LC50≤10mg/L例如：LD50≤1000mg/kg就是说，人的重量70kg的话，摄入70g为中毒死掉1 剧毒品急性毒性为：经口LD50≤5mg/kg；经皮接触24h LD50≤40mg/kg；吸入1h LC50≤0.5mg/L。
2 有毒品急性毒性为：经口LD50：5 -50mg/kg；经皮接触24h LD50：40 - 200mg/kg；吸入1h LC50：0.5 - 2mg/L。
3.3 有害品急性毒性为：固体经口LD50：50 - 500mg/kg；液体经口LD50：50 - 2000mg/kg；经皮接触24h LD50：200 - 1000mg/kg；吸入1h LC50：210mg/L。
亚急性和慢性毒性动物经亚急性和慢性染毒后的毒作用表现及组织病理学检查所见。
刺激性为毒物对动物眼睛和皮肤的刺激性实验数据。
刺激强度分轻度、中度和重度。
致突变性以沙门氏菌回变试验(Ames试验)数据为主，适当收录大小鼠、人及其它试验数据。
生殖毒性以动物(尤其是大小鼠)吸入和口服的生殖毒性实验数据为主；均为最低中毒剂量或浓度(TDL0或TCL0)下的数据。
致癌性采用国际癌症研究中心 (IARC) 专家小组的评定结论。
《食品毒理学》经口急性毒性试验
《食品毒理学》经口急性毒性试验一、实验目的和要求掌握给药方法；了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试动物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
二、主要仪器设备实验动物：成年昆明系实验小鼠（SPF级别）。
器材：注射器（0.25，1，2，5ml）、吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml）、容量瓶（10，25，50ml）、烧杯（10，25，50ml）、滴管、灌胃针12号、动物体重秤、解剖剪刀、镊子、手术手套，口罩。
试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
三、实验原理氯化钡是强电解质，可完全电离出钡离子，导致钡离子在小鼠血液内部引发急性低钾血症，故小鼠会出现肌无力和发作性软瘫，心肌应激性减低，各种心律失常和传导阻滞，由于肌无力，严重中毒的小鼠还会出现呼吸困难乃至死亡等症状。
四、实验内容1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
（1）预实验，取小白鼠、称重、随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液，摸索小鼠接近100%和0%死亡的剂量范围。
（2）小鼠随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法：将钝头的12号注射针（适用于小鼠），安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤（小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧），将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。
注意使动物的上消化道固定成一直线。
右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。
若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。
如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
GBZ240.6-急性皮肤刺激试验
无红 斑 轻微 红 斑 红斑 和焦痂形成 明显 红 斑
1
72h各 观察时点最高积分均值 ,按 表 2判 定皮肤刺激强度 。
1
皮肤刺激反应评分
评 分
2
中等程度到重度程度 红斑 严重红斑至焦痂形成
GBz/T240.6-2011
表 1(续 )
皮 肤 反 应 无水肿 很轻微水肿 水肿形成
1
评
分
6.4.2 染毒
取受试样 品 0.5mL(g)直 接涂布在皮肤 上 ,用 4层 纱 布 (2.5cm× 2.5cm)和 一层玻璃 纸或类似物 覆盖 ,再 用无刺激性胶布和绷带加 以固定 。对侧皮肤作 为对 照 。采用封 闭试 验 ,敷 用 时间为 4h。 试 验 结束后 ,用 温水或无刺激性溶剂清除残 留受试样 品 。 如怀疑受试样 品可能引起严重刺激或腐蚀作用 ,可 采用分段试验 ,将 三个涂布受试样 品的纱布块 同 时或先后敷贴于一 只家兔背部脱 毛区皮肤上 ,分 别 于涂敷后 3min、 60min和 4h取 下一块纱 布 ,皮 肤涂 敷部位在任 一时间点积分等于 8分 ,即 可停 止试验 。
限 内观察 和评 价 刺激 反 应 的程
作详细的记录 。
1犭
以进行 可 逆 或不 可逆效 应 的观 察 ,以
便进行完整 的评价 ,但 一般不超过
强碱物质 (pH≥ 11),由 于可预见其腐蚀特
性 ,不 必做本试验 ;若 已知受试样 品有很强 的经皮 吸收毒性 (LD5。 ≤ zOO mg/kg体 重 )的 物质不必进行本 试验 ;在 充分并公认 的体外试验结果 中确定可能产生腐蚀或刺 激 毒性 的物质不必进 行体 内试 验 。如果 从受试样 品的结构活性构效关系可 以预见 潜在 的腐蚀毒性 ,则 不必做本试验 。
毒理学基础 第六章 化学物的一般毒性作用
〔四〕慢性实验设计要点
1.实验动物 2.染毒途径与期限
3.剂量分组: 高剂量组：1/5-1/2 LOAEL〔亚慢〕 中剂量组：1/50-1/10LOAEL 低剂量组：1/100 LOAEL或：1/1000-1/10LD50 阴性对照：
4.观察指标 同亚慢，但精，为亚慢显现靶的指标。
〔五〕结果评价
染毒使半数动物出现相同效应〔或死亡〕的剂量[ED50(1)]
的比值，K 即= 蓄ED5积0(n)系数。
ED50(l)
LD50(n
K
=
)
LD50(l
)
1)固定剂量法 2)剂量递增法
〔2〕生物半减期法
用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用 化学物的蓄积极限：
a.半减期的测定 b.计算蓄积极限
第六章 化学物的一般毒性作用
急性毒性 一般毒性亚慢性毒性
慢性毒性
急性毒性试验 亚慢性毒性试验 慢性毒性试验
第一节 急性毒性作用
一、急性毒性的概念
➢ 急性毒性(acute toxicity) ：是指机体〔实验动物或人〕 一次或24小时内屡次接触外源化学物后在短期内所引 起的毒性效应。
➢ 包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应 ➢ 说明： ➢ 1.接触的次数：一次/屡次 ➢ 2.毒效应出现时间： ➢ 3.中毒效应的强度：
〔二〕染毒途径
1.经消化道染毒 2.经呼吸道染毒 3.经皮肤染毒 4.经注射染毒
〔三〕剂量选择及分组
1.剂量范围确实定： 动物死亡率0％－100％ 〔或10％-90%〕的致死剂量范围
2.分组及剂量确实定： 窛氏法：6－8组为宜，各组剂量呈等比级数 霍恩氏法：4组，各组剂量呈等比级数
〔四〕毒作用观察
毒理学实验
七、毒理学实验（一）、急性毒性试验的定义、目的和意义急性毒性试验，又称单次给药急性毒性实验，是指在24h内一次或多次给予动物受试物后，所产生的毒性反应。
（二）、基本内容和技术要求1、实验动物可根据不同情况选用不同的实验动物，例如大鼠、小鼠、犬。
本实验随机选用健康成年的12只大鼠和12只小鼠，要求雌雄分别对半，动物初始体重不超过或低于平均体重的20%。
2、给药途径由于本品为浓缩丸，因此选用口服进行实验。
给药前将实验动物禁食24h。
3、给药剂量将大鼠和小鼠分别两只一组，分大鼠6组，小鼠6组。
然后编号。
分剂量0g/kg，1g/kg，2g/kg，3g/kg，4g/kg，5g/kg对小鼠和大鼠进行灌胃口服，20ml/kg。
然后观察小鼠反应。
一般认为口服5g/kg时未见急性毒性或死亡，可不必提高剂量进行实验。
4、观察时间及指标给药后几小时内应严密观察动物反应，之后每天上下午各观察一次，至少连续观察14d。
5、在口服给药24h后，如果没有实验动物死亡，则每组各选一只动物进行病理组织学检查；如果有动物死亡，则将死亡动物和未死亡的动物小组中选一只动物进行病理学检查。
6、实验动物临床表现与器官系统的关系急性毒性试验一般指征观察参考表（三）、长期毒性实验实验要求和内容1、实验药品要求选用符合相关制剂要求的同一批药品。
2、实验动物选用正常、健康、雌雄各半和动物体重应在平均体重的20%之内的成年各20只大鼠和小鼠。
将每种动物平均分四组，分别为高、中、低、和对照组。
3、实验动物饲养按照动物室正常标准进行饲养。
4、药物剂量根据相应动物急性毒性的最大无症状剂量（MTD）、1/3MTD、1/10MTD 分别设高中低三个剂量。
对照组为空白对照。
5、给药方法将药物加入到饲料中，依据确定的量进行。
6、给药时间给药6个月。
7、观察指标（1）一般指标实验动物的体重，和解剖后相关脏器的重量。
每周固定时间测1次大鼠体重及摄食量，试验期间详细观察大鼠一般状况，包括外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便等，必要时应测定大鼠饮水量。
卫生毒理学――第六章 化学毒物的一般毒性作用
卫生毒理学――第六章化学毒物的一般毒性作用急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或实验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
急性毒性试验(acute toxicity tests)是基础毒理研究的主要内容之一．其目的是：①测试和求出化学毒物对一种或几种实验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度．②并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。
③探求化学毒物急性毒性的剂量―反应关系与中毒特征。
④为亚慢性、慢性毒性作用试验的研究及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标的选择提供参考依据。
⑤为毒理学机制研究提供线索。
常用参数最常用的是半数致死量(LD50)和急性毒作用带(Zac)。
Zac值的大小可反映急性阈剂量距离LD50的宽窄，即表示引起实验动物的死亡剂量与最低毒作用剂量之间剂量范围的宽窄。
zac值越大、表明化学物引起急性死亡的危险性越小，反之表明引起急性死亡的危险性越大。
实验方法的要点(一)实验动物[原则]：①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的实验动物。
②动物易于获得③品系纯化④价格较低和易于饲养等条件。
1．实验动物的种属不同种属的动物对化学物的反应可能有很大的差别，最好用两种种属的动物，包括啮齿类和非啮齿类。
实际工作中啮齿类多选用小鼠和大鼠，有些试验也可选用豚鼠或家兔，非啮齿类一般选用狗或猴。
一般来说，急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔．而急性吸人毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。
2．实验动物的年龄急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行实验，而且须是未曾交配和受孕的动物。
由于小动物年龄与体重相关．一般用体重表示。
化妆品急性毒性试验
化妆品急性毒性试验什么是化妆品急性毒性试验？化妆品急性毒性试验指采用动物试验的方式来评价化妆品对人体产生近期毒性危害的试验。
化妆品急性毒性试验做什么项目的？化妆品急性毒性试验包括急性皮肤毒性试验与急性经口毒性试验两项内容。
（一）急性皮肤毒性试验：1.试验目的急性皮肤毒性试验可确定受试物能否经皮肤吸收和短期作用所产生的毒性反应，可为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他毒理学试验剂量提供依据。
试验方法受试物液体受试物一般不需稀释。
若受试物为固体，应研磨成细粉状，并用适量水或无毒、无刺激性、不影响受试物穿透皮肤、不与受试物反应的介质混匀，以保证受试物与皮肤有良好的接触。
常用的介质有橄榄油、羊毛脂、凡士林等。
实验动物和饲养环境可选用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作为实验动物，也可使用其他种属动物进行试验。
使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的。
建议实验动物体重范围为：大鼠200g—300g；家兔2kg—3kg；豚鼠350g—450g。
实验动物皮肤应健康无破损。
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d—5d 时间。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用标准配合饲料，饮水不限制。
剂量水平根据所选用的方法要求，原则上应设4—6 个剂量组，每组动物一般为10 只，雌雄各半。
各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试。
如果受试物毒性很低，可采用一次限量法，即用10 只动物（雌雄各半）皮肤涂抹2000mg/kg 体重剂量，当未引起动物死亡，可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。
（二）急性经口毒性试验：试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他毒理学试验剂量的依据。
试验方法受试物受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中，建议首选水，其次是植物油(如玉米油)，或考虑使用其他介质（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。
急性毒性-毒理学基础-精简版
2.阐明受试化合物急性毒性的中毒特征 2.阐明受试化合物急性毒性的中毒特征
通过观察动物中毒表现、 通过观察动物中毒表现、毒作用强度和死亡 情况，初步认识中毒情况 为预防及治疗提供依据。 认识中毒情况， 情况，初步认识中毒情况，为预防及治疗提供依据。
急性毒性试验所用大鼠的品系以 SD、Wistar为主； 、 为主； 为主
小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多 小鼠则以昆明种、 、 为多
豚鼠 ，皮肤致敏试验首选
兔，眼刺激试验首选
Beagle犬 犬
猕猴
----实验动物的选择 ----实验动物的选择
-----微生物学等级和饲养环境 -----微生物学等级和饲养环境
兔
SD大鼠 大鼠
金黄仓鼠
豚鼠
非啮齿类动物： 非啮齿类动物：
犬 猴 猪
2.常用实验动物的物种和品系
首选哺乳动物 哺乳动物中首选大鼠、 哺乳动物中首选大鼠、小鼠
若规定用两种物种：啮齿类：大鼠、 若规定用两种物种：啮齿类：大鼠、小鼠 非啮齿类： 非啮齿类：犬或猴 根据不同接触途径， 根据不同接触途径，选择不同的物种
三、一般毒性试验方法的要点
实验动物的选择 1. 实验动物的选择 受试物处理及 2. 受试物处理及染毒方式的选择 3. 染毒剂量与设组 染毒剂量与设组 观察周期， 4. 观察周期，观察指标的选择 5. 计算方法和评价
----实验动物的选择 ----实验动物的选择
实验动物的选择
种属和品系
性别、年龄、 性别、年龄、体重
toxicity
Acute toxicity
化妆品申报注册备案时毒理学检验项目有哪些
化妆品备案申报应做的毒理学检验项目经常会有化妆品备案企业询问产品备案时都需要做些什么项目,但解释半天却又一头雾水。
因此，北京天健华成国际投资顾问有限公司化妆品注册部的同学工作之余就写一些文字，以期解惑。
不许抄袭哦！一、化妆品涉及的常见毒理学检验项目（1）急性经口和急性经皮毒性试验（2）皮肤和眼刺激性试验（3）皮肤变态反应试验（4）皮肤光毒性试验（必要时）（5）Ames鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验（6）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验二、不同类别化妆品成品的毒理学检验项目不同类别化妆品的检验项目一样吗？当然不一样，化妆品的类别是决定检验项目的关键。
我国将化妆品分为两大类，即：特殊用途化妆品和非特殊用途化妆品。
特殊用途化妆品按功能分为9类，即：育发、美乳、健美、防晒、祛斑、染发、烫发、脱毛、除臭。
非特殊用途化妆品（俗称普通化妆品）可分为：发用品、护肤品、彩妆品、指（趾）甲用品、芳香品。
下面就来分别看看它们对应的检验项目。
1、非特殊用途化妆品应进行的毒理学检验项目（1）发用品（2）护肤品（3）彩妆品（4）芳香品、指（趾）甲用品注： 1.免洗护发类不做急性眼刺激性试验。
2.不需进行试验。
3.进行急性皮肤刺激性试验，不需进行多次皮肤刺激性试验。
4.不需进行眼刺激试验。
5.对于紫外线吸收剂加入量≥0.5%的产品,还应进行皮肤光度试验和皮肤变态反应试。
表中未涉及的产品，在选择试验项目时应根据实际情况确定，可按具体产品用途和类别增加或减少检验项目。
多色号系列非特化妆品多色号系列化妆品是指：产品配方除色素(色调调整部分)种类或含量不同外，其余配方成分种类相同，且系列名称相同的普通化妆品。
该系列产品应作为一组产品同时申报。
抽样检验原则：抽样比例30%，不足10个，以10个计。
首选含有机色素和色素含量高的产品，如果含量相同，则选择色素种类最多的产品。
2、特殊用途化妆品应进行的毒理学检验项目注：3. 除育发类、防晒类和祛斑类产品外，紫外线吸收剂加入量≥0.5%的其他产品,还应进行皮肤光毒性试验。
4-1急性毒性试验概述及染毒方法
4-1急性毒性试验概述及染毒方法第一节急性毒性试验概述及染毒方法一、概念和试验目的(一) 急性毒性概念急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。
但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。
有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。
而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。
此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。
凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。
而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。
(二) 实验目的1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。
2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。
3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。
也可用于研究急救治疗措施。
二、实验动物和染毒方法(一) 实验动物选择在卫生毒理学领域中，体内试验以实验动物为研究对象，最终是为了阐明受试外来化合物对人的急性危害性质和危害强度。
所以选择实验动物时，要求在其接触化合物之后的毒性反应，应当与人接触该化合物的毒性反应基本一致，虽然利用任何一种或几种实验动物的急性毒性结果向人外推都必须十分慎重，但这一选择实验动物的原则仍非常重要。
1.物种选择以选择哺乳动物为主。
目前实际应用中以大鼠和小鼠为主，尤以大鼠使用很多。
需指出大鼠并非对外来化合物都最敏感。
家兔常用于研究化合物的皮肤毒性，包括对粘膜的刺激。
猫、狗也用于急性毒性试验，但因价贵不易于大量使用。
猪为杂食动物，对一些化合物的生物效应表现与人有相似之处，尤其是皮肤结构与人较近似。
第五章 环境毒理学常用实验方法2
可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)
式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。
3．正式试验;
一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一 般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的 对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各 自的反对数即得出各组剂量的真实值。
大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 吞咽胶囊:
经呼吸道接触 : 静式吸入
动式吸入
经皮肤接触 : 注射途径接触:
（四）染毒剂量与分组: 1．查阅文献
①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发 度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。
1．固定剂量法：
一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD50，然后选取 相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组 至少20只，雌雄各半。试验组在1／20～l／50LD50的范围内选定一个剂量，每日 以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当 试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量 [LD50(n)]，根据公式计算K值，然后依表6—5进行评价。但若接触剂量已累积达 到5个LD50剂量，也可终止试验。
1
2
3
4
5
毒理学评价的四个阶段和内容
毒理学评价的四个阶段和内容通常包括以下：
1. 急性毒性试验（Acute Toxicity Testing）：
这是毒理学评价的第一阶段，主要目的是确定物质在短时间内（通常是一次或几次接触后）对生物体产生的有害效应。
内容包括：经口、皮肤接触和吸入途径的急性毒性试验，计算LD50（半数致死剂量），即导致一半实验动物死亡的剂量。
2. 遗传毒性试验（Genotoxicity Testing）：
这个阶段评估物质是否能够引起遗传物质（DNA）的损伤，这可能导致突变、癌症或其他遗传疾病。
内容包括：Ames试验（细菌回复突变试验）、染色体畸变试验和微核试验等。
3. 亚慢性毒性试验（Subchronic T oxicity Testing）：
在这个阶段，物质的毒性效应在较长时间内（几周到几个月）被研究。
内容包括：重复剂量毒性试验，观察动物的行为变化、体重变化、血液学参数、生化指标、器官重量和病理学改变等。
4. 慢性毒性试验和致癌性试验（Chronic T oxicity and Carcinogenicity Testing）：
这是最长的一个试验阶段，通常持续数月到数年，旨在评估物质长期暴露对生物体的影响，包括潜在的致癌性。
内容包括：生命周期研究，观察生长发育、生殖能力、寿命以及肿瘤发生率等。
在这些试验中，除了直接的毒性效应外，还会考虑物质的代谢途径、蓄积效
应、剂量-反应关系以及敏感群体（如孕妇、儿童和老人）的特殊反应。
这些信息对于全面评估物质的安全性和风险管理至关重要。
值得注意的是，具体的试验设计和要求可能会根据监管机构的指导原则和物质的特性进行调整。
消毒产品毒理学实验基本要求
消毒产品毒理学实验基本要求为了确保消毒剂的安全性，消毒剂除在配方组分或杂质（污染物）含量方面必须达到国家有关部门颁发的相关技术法规或强制性标准对它们的禁用或限用的要求外，消毒剂还需进行相应的安全性毒理学评价。
1消毒产品毒理学实验评价程序消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。
（1）第一阶段（急性毒性试验、皮肤刺激试验和黏膜刺激试验）1）急性经口毒性试验2）急性吸入毒性试验3）皮肤刺激试验4）急性眼刺激试验5）阴道黏膜刺激试验6）皮肤变态反应试验（2）第二阶段（亚急性毒性试验和致突变试验）1）亚急性毒性试验2）致突变试验①体外哺乳动物细胞基因突变试验（体细胞基因水平，体外试验）1.5178Y细胞基因突变试验V79细胞基因突变试验②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体外试验）③小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验（体细胞染色体水平，体内试验）④哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体内试验）⑤程序外DNA修复合成试验（DNA水平，体外试验）⑥小鼠精子畸形试验（性细胞基因和染色体水平，体内试验）⑦睾丸生殖细胞染色体畸变试验（性细胞染色体水平，体内试验）小鼠精原细胞染色体畸变试验小鼠精母细胞染色体畸变试验（3）第三阶段（亚慢性毒性试验和致畸胎试验）1）亚慢性毒性试验2）致畸胎试验（4）第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）1）慢性毒性试验2）致癌试验2各种消毒产品毒理学试验的规定为便于对消毒剂进行毒理学评价，将消毒剂分为三类。
（1）第一类消毒剂：指我国首创或根据国内外文献报道首次生产的消毒剂。
原则上需进行上述4个阶段的毒理学试验。
首先必须做急性经□毒性试验（包括小鼠和大鼠）、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验和三项致突变试验（包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验）。
根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。
（2）第二类消毒剂：指国外已批准生产、现由我国首次生产或首次进口的消毒剂。
专题一兽药的毒理学试验和安全性评价
含底层 培养基 的平皿
8.结果评价
受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂 量反应关系和重现性，判为诱变阳性。
二、微核试验
原理： 骨髓细胞染色体经诱变物作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂 后期不移向两极，在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而存留于细胞浆中，形 成一个或几个圆形至杏仁状的结构，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核 小，故称微核（micronucleus）。
37 ℃水浴 增菌培振养荡液培养
增菌培养液
增菌培养液
活菌数不得少于1～2 x 109/ml
增菌培养液
试验步骤
受检物 + 菌液 + S9混合液 或磷酸盐缓 （0.1-0.2ml） （0.1ml） （0.5ml）
加入45 ℃顶层 培养基2ml 混匀
37 ℃水浴 振荡培养20imns
无菌小试管 37 ℃培养48h
组别
剂量
(mg/kg)
1
300
对数剂量 (Xi)
2.4771
2
360
2.5563
3
432
2.6355
4
518
2.7143
5
622
2.7938
合计
-
-
实验动 物数(ni)
10 10 10 10 10 -
死亡动物 数(ri) 0 2 5 7 10 ∑ ri24
死亡率 (pi) 0 0.2 0.5 0.7 1.0
原理：
图示
嗜多染红细胞
诱变物
微核直径相当于红细胞直径的1/20～1/5。
1.动物 成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。 10只/组，雌雄各半。
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实验条件：
表4 眼刺激性反应观察结果
眼刺激性反应积分 动 物 编 号 1
不冲洗□ 30秒冲洗□
部位
样品 结膜 虹膜 角膜
1h 对照 样品
24h 对照 样品
48h 对照 样品
72h 对照 样品
4d 对照 样品
7d 对照
2
结膜 虹膜 角膜
3
结膜 虹膜 角膜
【实验方法】
• l. 选择健康实验动物，称重、编号，检查动物双眼有无异常 • 2. 去毛:在家兔腹部选3块2×2cm2的面积，用剪刀小心剪毛，注 意不可损伤表皮，剪毛后用棉签蘸取脱毛剂去除残毛，使皮肤 完全显露。去毛后用水清洗残留脱毛剂，并用棉签擦干。 • 3. 取受试物0.5ml(固体取0.5g)，分别涂在家兔显露皮肤上， 并选一处涂以蒸馏水作为对照，作好定位记录。 • 4. 轻轻拉开实验动物一侧的下眼睑，将受试物0.1ml(固体取 0.lg)滴入或涂入一侧目结膜囊内，另一则用赋形剂作为对照， 给受试物后使眼睛闭合一段时间，用生理盐水冲洗（不同受试 物规定不同）。 • 5. 1小时后观察皮肤、眼结膜、角膜、虹膜反应。
◈欧盟
♣ 企业安全性评价员对“化妆品规程”附件以外化妆品成分安全性 评价的毒理学资料要求
1. 2. 3. 4. 急性毒性（经口、经皮或吸入） 皮肤和眼刺激性 过敏性 致突变性
急性皮肤、眼刺激性实验
• • • • • • 【实验目的】 【实验原理】 【实验材料】 【实验方法】 【实验结果】 【实验报告】
3
4
附表2 皮肤刺激强度评价
刺激强度
无刺激性
分值
0.0-0.4
轻刺激性
中等刺檄
0.5-1.9
2.0-5.0
强烈刺激
5.1-8.0
【实验结果】
刺激反应积分和刺激强度评价
受试物 化妆品1号 化妆品2号 皮肤刺激反应评分 红斑形成 水肿形成 总积分 刺激强度评价
眼刺激观察
眼损害
表1
眼损害的评分标准
积分 0 1 2 3 4
◈欧盟 ♣对于在“化妆品规程”附件III和IV列出的染发剂的特殊要求 需提供下列3项试验： 1. 细菌回复突变试验 2. 体外哺乳动物细胞基因突变试验（优选小鼠 淋巴瘤试验） 3. 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外哺 乳动物细胞微核试验。 当上述3项试验结果以及定量构效关系、理化特性等显示，受试 染发剂可能具有致突变性或遗传毒性时，可能要求增加致突变试验 项目。
【实验目的】
•确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或 腐蚀作用及其程度。
【实验原理】
皮肤接触受试物后，化妆品中含有的原发性刺激物质刺激皮肤 神经末梢使血管扩张、渗出而产生相应的可逆性炎症反应。根据反应 的强弱记录积分，评价受试物的刺激强度。
【实验材料】
• 1.仪器 动物体重称、外科剪刀、烧杯、棉签等 • 2.实验动物健康成年豚鼠或家兔，每种受试物4-8只。 • 3.试剂 蒸馏水、脱毛剂(10%硫化钠)，待检化妆品2种
结膜：充血（指睑结膜、球结膜部位） 血管正常 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 水肿 无 轻微水肿（包括瞬膜） 明显水肿，伴有部分眼睑外翻 水肿至眼睑近半闭合 水肿至眼睑大半闭合
0 1 2
0 1 2 3 0 1 2 3 4
表2
眼刺激性反应分级
2A级（轻刺激性） 2/3动物的刺激反应积分均值：角膜浑浊≥1；虹膜≥1；结膜充血≥2；结膜水 肿≥2和上述刺激反应积分在≤7天完全恢复
微刺激性 可逆眼 损伤 轻刺激性 刺激性 不可逆 眼损伤
眼刺激性反应分级
动物的角膜、虹膜积分=0； 结膜充血或结膜水肿积分≤2，且积分在＜7天内降至0
动物的角膜、虹膜、结膜积分在≤7天降至0 动物的角膜、虹膜、结膜积分在8～21天内降至0 ①动物的角膜、虹膜和/或结膜积分在第21天时＞0； ② 2/3动物的眼刺激反应积分：角膜浑浊≥3和/或虹膜=2
谢谢
◈欧盟 ♣ SCCP评价“化妆品规程”附件中的物质所需的毒理学资料 一、一般性毒理学资料 1.毒理学试验研究资料 2.其他资料 二、对于在“化妆品规程”附件III和IV列出的染发剂的特殊要求 ♣ 企业安全性评价员对“化妆品规程”附件以外化妆品成分安全 性评价的毒理学资料要求
◈欧盟 ♣ SCCP评价“化妆品规程”附件中的物质所需的毒理学资料 一般性毒理学资料——毒理学试验研究资料 1.急性毒性（有的话） 2.刺激性和腐蚀性 3.皮肤过敏性 4.皮肤/经皮吸收 5.重复染毒毒性 6.致突变性/遗传毒性 7.致癌性 8.生殖毒性 9.毒代动力学 10.光诱发毒性 11.人体资料
角膜：混浊（以最致密部位为准） 无溃疡形成或混浊 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 角膜混浊，虹膜无法辨认
虹膜：正常 皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应 出血、肉眼可见破坏，对光无反应（或出现其中之一反应）
急性皮肤、眼刺激试验
前言：安全性评价所需毒理学资料
◈中国《化妆品卫生规范》2007 化妆品的新原料，一般需进行下列毒理学试验： ♣急性经口和急性经皮毒性试验 ♣皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验 ♣皮肤变态反应试验 ♣皮肤光毒性和光敏感试验（原料具有紫外线吸收特性需做该项试） ♣致突变试验（至少应包括一项基因突变试验和一项染色体畸变试验） ♣亚慢性经口和经皮毒性试验 ♣致畸试验； ♣慢性毒性/致癌性结合试验 ♣毒物代谢及动力学试验 ♣根据原料的特性和用途，还可考虑其它必要的试验，如果该新原料与已 用于化妆品的原料化学结构及特性相似，则可考虑减少某些试验 ◈ 今后有可能根据具体情况提出具体要求
附:评分标准(摘自GB7919)
皮肤反应 红斑和焦痂形成 无红斑 轻微红斑（勉强可见）
表1 皮肤刺激反应评分
积分 0 1
明显红斑
中度~重度红斑 严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成 水肿形成 无水肿 轻微水肿 轻微水肿（勉强可见）
2
3 4 0 1 2
轻度水肿（皮肤隆起轮廓清楚）
中度水肿（皮肤隆起约1mm） 重度水肿（皮肤隆起超过1mm，范围扩大）
可逆眼损伤 2B级（刺激性） 2/3动物的刺激反应积分均值：角膜浑浊≥1；虹膜≥1；结膜充血≥2；结膜水 肿≥2和上述刺激反应积分在＜21天完全恢复
不可逆眼损伤
任1只动物的角膜、虹膜和/或结膜刺激反应积分在21天的观察期间没有完全恢 复 2/3动物的刺激反应积分均值：角膜浑浊≥3和/或虹膜＞1.5
表3
刺激反应分级
实验报告
• • • • • • • • 包括内容： 目的 原理 内容 材料和试剂 操作步骤 实验结果 结果评定
其中应包含以下内容 试验报告应包括如下内容： 1.受试物名称、理化性状、配制方法和用量，必要时说明受试物的pH值； 2.实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）； 3.实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合 格证号； 4.列表显示每只动物在每一观察时点（如染毒1，24，48和72h）的刺激 反应（建议的表格形式见表4），将实验条件不冲洗和30秒冲洗的 结果分别列表； 5.具体描述除眼部以外的其它作用； 6.描述在各观察时点积分时的检查方法（如手持裂隙灯、用荧光素钠）； 7.结论。