王鸿利 遗传性凝血因子和抗凝因子缺陷

研究方法-筛选试验和表型诊断实验
2.vWD筛选试验：
①BT ②APTT ③FVIII:C
3. 抗凝因子缺陷筛选试验：
①APCR ②proGlobal试验
研究方法-筛选试验和表型诊断实验
4. 凝血因子缺陷症表型诊断试验：
Fg(clauss法)
FII:Ag FII:C
FV:Ag FV:C
FVII:Ag FVII:C
研究方法-临床诊断
血栓病 以抗凝血酶 缺陷症为例
浅静脉炎 深静脉血栓 内脏静脉血栓 肺栓塞
研究方法-家系调查（FVIII)
研究方法-家系调查（FVII)
研究方法-家系调查（AT缺陷症)
研究方法-筛选试验和表型诊断实验
1. 凝血因子缺陷症筛选试验：
①APTT↑，PT正常：因子VIII缺陷症 （血友病A）、因子IX缺陷症（血友病B ）、因子XI缺陷症 因子XII缺陷症 ②APTT正常，PT↑：因子VII缺陷症 ③APTT↑，PT↑：因子X缺陷症、因子V 缺陷症、凝血酶原缺陷症、纤维蛋白原（ Fg）缺陷症 ④APTT正常，PT正常：因子XIII缺陷症
研究方法-携带者和产前诊断
传统方法：采集羊水
单细胞植入前诊断
研究方法-血友病携带者和产前诊断
传统方法
血友病A FⅧ内含子22倒位（INV22）、DXS52、BclⅠ、内含子13
（CA13）和内含子22（CA22）等5个基因位点进行检测 血友病B
应用DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094 和DXS1227等6个位点的STR作基因分析
遗传性凝血因子和抗凝因子缺 陷症的诊断与血友病A的基因治疗
上海交通大学附属瑞金医院 上海血液学研究所
王鸿利 王学锋 等
研究背景
遗传性凝血因子缺陷症和 抗凝因子缺陷症分别导致 遗传性出血病和血栓病
患者往往自幼发病，持续 终生，致残率高、危害性 大、甚至导致死亡，并遗 传至后代
替代治疗仍是目前唯一有 效的治疗手段，基因治疗 是根治本病的最佳选择
Western 免疫荧光染色 印迹
Hewitt J,et al.Severe FVII deficiency caused by a new point mutation combined with a previously undetected gene deletion. Br J Haematol. 2005;128(3):380-5.
研究方法
植入前遗传学诊断
（preimplantation genetic diagnosis，PGD）
体外受精
胚胎发育6-8细胞
1~2个单卵裂球细胞
活检取单个细胞
FVIII/IX基因分析
单细胞PCR技术
正常胚胎植入宫内
凝血因子性质
抗凝因子性质
凝血/抗凝因子机制
国内外研究现状
遗传性凝血因子缺陷症 种类
研究方法-体外表达研究
其他研究: 根据突变位点的特殊性，设计特异性的功 能研究试验 例如针对在信号肽或糖基化位点发生的突 变等，可采用体外无细胞蛋白翻译试验， 研究突变导致缺陷症的详细分子发病机制
研究方法-血友病携带者和产前诊断
研
外周血DNA抽提
羊水DNA抽提
究Hale Waihona Puke Baidu流
（携带者）
（胎儿）
程
PCR扩增
无（异常）纤维蛋白原血症 凝血酶原缺陷症 凝血因子V缺陷症 凝血因子VII缺陷症 凝血因子VIII缺陷症 凝血因子IX缺陷症 凝血因子X缺陷症 凝血因子XI缺陷症 凝血因子XII缺陷症 凝血因子XIII缺陷症 血管性血友病
FVIII:Ag FVIII:C
FIX:Ag FIX:C
FX:Ag FX:C
FXI:Ag FXI:C
FXII:Ag FXII:C
FXIII:Ag FXIII:C
vWFR:cof vWF:Ag 多聚体分析
研究方法-筛选试验和表型诊断实验
5. 抗凝因子缺陷症的表型诊断试验：
AT:A AT:Ag TPS:A FPS:A PAI:A PAI:Ag α2-AP:A α2-AP:Ag
研究方法-分子（基因）诊断
6.抗凝因子缺陷症：AT缺陷症、PC缺陷症、 PS缺陷症
采用PCR扩增所有外显子及其侧翼序列，基 因测序的方法进行基因诊断 采用限制性酶切分析或ASPCR对发现的基 因突变进行验证
研究方法-体外表达研究
研
构建突变基因cDNA的表达载体
究
流
程
转染真核细胞
生物代谢标记 活性与抗原 检测
内含子1,22倒位
直接核酸测析
间接联锁分析
明确诊断
Lavery S.Preimplantation genetic diagnosis: new reproductive options for carriers of haemophilia. Haemophilia. 2004;10 :126-32
研究方法-分子（基因）诊断
5.其他凝血因子缺陷症：无（异常）纤
维蛋白原血症、凝血酶原缺陷症、因子V、 VII、X、 XI、XII、 XIII缺陷症 采用PCR扩增所有外显子及其侧翼序列，基因测 序的方法进行基因诊断 采用限制性酶切分析（RFLP)或等位基因特异性 PCR（ASPCR）对发现的基因突变进行验证
研究内容
研究对象
研究对象
项目 携带者诊断 产前诊断
血友病A 74 40
血友病B 17 6
合计 91 46
p
q
研究流程
家系资料
临床资料
实验表型
基因诊断 体外表达研究
临床诊断 临床治疗
研究方法-临床诊断
出血病 以血友病A为例 出血为特征
大关节 肌肉 腰大肌 内脏 皮肤粘膜 皮肤淤斑 颅内出血
PC:A PC:Ag t-PA:A t-PA:Ag PLG:A PLG:Ag TAFI:A TAFI:Ag
研究方法-分子（基因）诊断
检测流程
DNA/RNA抽提
PCR扩增（RT-PCR、ASPCR）
DGGE 直接核酸测序
RFLP
研究方法-分子（基因）诊断
研究方法-分子（基因）诊断
研究方法-分子（基因）诊断
3.因子VIII缺陷症（血友病A）：
基因位点检测：BclI、CA13、CA22的STR 以及DXS52（ST14）阳性率49% 直接测序 阳性率100％
研究方法-分子（基因）诊断
4.因子IX缺陷症（血友病B）：
用长距离PCR（LD-PCR）测定 DXS102、 DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094 和DXS1227等6个位点的STR作基因分析，阳 性率达100%