8.核酸扩增技术
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以广泛应用。
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College
基 本
N= N0(1+E)c
原
理
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College
PCR反应体系、条件及其优化
n PCR反应体系
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College
碱基分布的均衡性
GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。 上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火 温度不利于提高PCR的特异性
引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基 互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严 重影响DNA聚合酶的延伸。
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引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需 严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’ 端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不 要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误 引发机率增加。
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数， 从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有 的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College
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引物设计总原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹
结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
应(即错配)。
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模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase)
dNTP PCR缓冲液（PCR buffer）
n PCR反应条件
变性 退火 延伸 循环
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引物设计一般原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
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引物长度
一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段 PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超 过50个核苷酸。
引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必 要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在 人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ). 而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有 1/400个.
较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序 列或者使用于产生一些突变位点
→பைடு நூலகம்Sense primer
3’ 5’
5’
← 3’
Antisense primer
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引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地 位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异 结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的 灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效 的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密 切相关。
模板（template ）
DNA
基因组DNA
RNA：总R质粒NDAN、A mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA
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引物（primers)
n 引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
同一碱基连续出现不应超过5个
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引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
主要内容
第一节 聚合酶链反应技术 第二节 荧光定量PCR技术 第三节 其他核酸扩增技术 第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制
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第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR
一、 PCR技术发展简史 二、 PCR技术原理 三、 PCR反应体系、条件及其优化 四、扩增产物检测及分析 五、 PCR常见问题与原因分析 六、PCR衍生技术
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PCR技术发展简史
Korana于1971年最早提出核酸 体外扩增的设想。
1985年Mullis等发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1993年诺贝尔化学奖获得者)
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PCR技术发展简史
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得
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基 本
N= N0(1+E)c
原
理
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PCR反应体系、条件及其优化
n PCR反应体系
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碱基分布的均衡性
GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。 上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火 温度不利于提高PCR的特异性
引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基 互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严 重影响DNA聚合酶的延伸。
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引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需 严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’ 端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不 要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误 引发机率增加。
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数， 从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有 的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
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引物设计总原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹
结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
应(即错配)。
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模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase)
dNTP PCR缓冲液（PCR buffer）
n PCR反应条件
变性 退火 延伸 循环
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引物设计一般原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
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引物长度
一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段 PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超 过50个核苷酸。
引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必 要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在 人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ). 而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有 1/400个.
较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序 列或者使用于产生一些突变位点
→பைடு நூலகம்Sense primer
3’ 5’
5’
← 3’
Antisense primer
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引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地 位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异 结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的 灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效 的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密 切相关。
模板（template ）
DNA
基因组DNA
RNA：总R质粒NDAN、A mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA
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引物（primers)
n 引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
同一碱基连续出现不应超过5个
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引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
主要内容
第一节 聚合酶链反应技术 第二节 荧光定量PCR技术 第三节 其他核酸扩增技术 第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制
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第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR
一、 PCR技术发展简史 二、 PCR技术原理 三、 PCR反应体系、条件及其优化 四、扩增产物检测及分析 五、 PCR常见问题与原因分析 六、PCR衍生技术
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PCR技术发展简史
Korana于1971年最早提出核酸 体外扩增的设想。
1985年Mullis等发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1993年诺贝尔化学奖获得者)
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PCR技术发展简史
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得