8.核酸扩增技术
核酸扩增技术的金标准
核酸扩增技术的金标准核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Technology，简称NAAT）是一种分子生物学技术，可在体外复制DNA或RNA分子，使其在数量上增加。
这项技术被广泛应用于生物学研究、疾病诊断和基因治疗等领域，可帮助实现精准医学和个性化治疗。
在NAAT中，最常用的方法是聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction），其核心是通过特定引物对目标DNA区域进行扩增，反复进行加热、退火和延伸过程，最终得到大量的目标DNA片段。
PCR的主要优点是高灵敏度、高特异性和快速反应时间。
此外，PCR还可以进行定量PCR（qPCR），通过监测荧光信号来精确测定反应体系中的DNA数量。
PCR虽然是NAAT的一种重要工具，但它也存在一些局限性，例如在复杂的生物样本中（如血液或组织样本）进行检测时可能会产生假阳性结果。
因此，科学家们开发了更复杂的NAAT方法，如逆转录PCR （RT-PCR）、荧光PCR（Fluorescent PCR）和病毒样本放大（Viral Sample Amplification）等技术。
近年来，NAAT技术的发展颇受关注，一个出色的例子是基于CRISPR-Cas的检测技术。
这种技术利用Cas9等“基因剪刀”将引物结合到目标DNA上，然后通过酶作用产生荧光信号，从而完成检测过程。
此外，基于PCR扩增和荧光检测的LAMP技术被广泛应用于疟疾、寄生虫感染和HIV等病毒感染的诊断。
总体来说，NAAT作为分子生物学的一个关键技术，在许多领域中都已证明其不断扩展的作用。
它不仅可以用于食品和环境监测，还可以用于病毒和疾病的诊断和治疗。
随着NAAT技术不断发展，我们可以期待更多创新应用的出现，这将不断推动医学、生物学和其他学科的发展。
核酸扩增技术
ATGC最好随机分布，避免连续4个以上相同核苷酸
2021/8/21
Logistics University of Chinese People’s Armed Police
31
Force
引物设计的原则
④避免引物内部出现二级结构 避免引物内部互补， 特别是2个引物间3’端的互补
⑤引物的特异性
与其它基因无明显同源性，3’端的碱基要求严格配对。
2021/8/21
14
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
DNA模板 DNA引物
dNTP TaqDNA聚合酶
2021/8/21
15
PCR的基本原 理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
Polymerase Chain Reaction
1993年
Karry Mullis
1985年发明PCR, 1993 年获诺贝尔化学奖
2021/8/21
2
PCR技术
（聚合酶链式反应, Polymerase Chain Reaction）
应用：DNA体外快速扩增技术，可将微量的目 的DNA在体外扩增100万倍以上。
⑥引物5 ’端可加上合适的酶切位点或修饰成分
扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分
子克隆很有好处
2021/8/21
Logistics University of Chinese People’s Armed Police
核酸扩增方法
核酸扩增方法
核酸扩增方法是一种将DNA或RNA复制成大量拷贝的技术，这些拷贝
可以用于科学研究、临床实验和工业生产等领域。
以下列举一些常见的核
酸扩增方法：
1.PCR（聚合酶链式反应）：PCR是最常见的核酸扩增技术，它利用DNA聚合酶在模板DNA上进行多轮反应，每一轮都会产生两倍的DNA拷贝。
PCR广泛应用于DNA测序、基因诊断、病毒检测、DNA重组等领域。
MP（环介导等温扩增）：LAMP是一种无需恒温器的核酸扩增技术，它利用DNA聚合酶在恒温条件下进行反应，在短时间内产生大量DNA
拷贝。
LAMP广泛应用于病原体检测、食品安全检测等领域。
3.NASBA（核酸序列基于扩增）：NASBA是一种RNA扩增技术，它利
用RNA聚合酶在恒温条件下进行反应，产生大量RNA拷贝。
NASBA广泛应
用于病毒检测、RNA表达分析等领域。
4.RCA（循环扩增反应）：RCA是一种DNA扩增技术，它利用DNA聚
合酶和DNA环化酶在恒温条件下进行反应，产生大量DNA环状结构。
RCA
广泛应用于DNA纳米技术、DNA分子计算等领域。
核酸扩增法检测方案
核酸扩增法检测方案引言核酸扩增法是一种常用的生物学技术，用于检测和分析特定DNA或RNA序列的存在和数量。
它是基于聚合酶链式反应（PCR）的原理，通过在特定的实验条件下，复制和扩增目标序列。
本文将介绍核酸扩增法的基本原理、实验方法和应用。
基本原理核酸扩增法基于聚合酶链式反应的原理，该反应是通过DNA聚合酶酶的作用，将DNA单链模板复制成双链DNA的过程。
聚合酶链式反应需要引物（primer），引物是由约20个核苷酸组成的寡核苷酸序列，能够与目标序列的两个端部的互补序列结合。
在PCR反应中，引物起到定向复制的作用，将目标序列的两端延伸复制。
通过反复进行PCR循环，可以从少量的起始DNA模板扩增出大量DNA产物。
实验方法核酸扩增法的实验方法通常包括以下步骤：1.样品处理：将待检测的样品进行前处理，如细胞裂解、DNA/RNA提取等，以获取目标DNA/RNA。
2.引物设计：根据待检测的目标序列设计引物。
引物应能够与目标序列的两端互补，且长度约20个核苷酸。
3.PCR反应体系准备：根据实验需求准备PCR反应的体系，包括DNA模板、引物、聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
4.PCR程序设置：根据目标序列的特性以及实验需求，设置PCR反应的循环条件、温度和时间等参数。
5.PCR循环扩增：将PCR反应体系放入热循环仪中进行PCR扩增。
每个循环包括三个阶段：变性、退火和延伸。
6.PCR产物分析：通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析，以确定目标序列是否扩增成功。
应用核酸扩增法在许多领域都有广泛的应用，包括：1.疾病诊断：核酸扩增法可以通过检测特定病原体DNA/RNA来进行疾病的早期诊断，例如新型冠状病毒的核酸检测。
2.遗传学研究：核酸扩增法可以用于检测基因突变、基因多态性等遗传学研究。
3.法医学：核酸扩增法可以用于法医学领域，对犯罪现场的DNA进行鉴定和分析。
4.生物工程：核酸扩增法在生物工程领域的应用较多，可以用于构建重组DNA、合成基因等。
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。
该技术具有与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求等优点。
核酸等温扩增技术是一类技术的统称，包括但不限于LAMP、NASBA、RCA、SAT、IMSA、RPA、SPIA等多种具体方法。
请注意，核酸等温扩增技术虽然具有诸多优点，但也有其局限性，例如可能存在交叉污染的风险，影响检测的准确性。
因此，在使用该技术时，需要采取有效的措施来避免这些问题。
核酸等温扩增技术及其应用
核酸等温扩增技术及其应用一、引言核酸等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，其在生物医学研究、临床诊断和基因工程等领域具有重要应用价值。
本文将详细介绍核酸等温扩增技术的原理、方法和应用。
二、核酸等温扩增技术的原理核酸等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的核酸扩增方法，通过利用逆转录酶和DNA聚合酶的活性，实现核酸的扩增。
其基本原理是通过逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA链，然后利用DNA聚合酶在恒温条件下合成新的DNA链。
这种等温扩增方法不需要复杂的温度变化，且具有较高的特异性和敏感性。
三、核酸等温扩增技术的方法核酸等温扩增技术主要包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增法）和RPA（等温扩增法）。
RT-LAMP方法利用4-6个特异性的引物，在同一温度下通过逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用，在短时间内扩增目标核酸。
RPA方法则利用DNA聚合酶和DNA单链结合蛋白在等温条件下，通过引物结合、DNA解旋、DNA聚合等步骤，实现核酸的扩增。
四、核酸等温扩增技术的应用1. 医学诊断：核酸等温扩增技术在医学诊断中有广泛应用。
例如，可以通过核酸等温扩增技术检测病毒、细菌和真菌等病原体，快速确认感染病原体的种类和数量，为临床治疗提供依据。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等，为早期癌症和遗传病的筛查提供技术支持。
2. 食品安全检测：核酸等温扩增技术可以应用于食品安全检测领域。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测食品中的病原菌、转基因成分和食品中的传染性病毒等。
这种技术具有快速、灵敏和高效的特点，可以为食品安全监管提供重要依据。
3. 环境监测：核酸等温扩增技术在环境监测中也有广泛应用。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测水体、土壤和空气中的微生物，了解环境中的微生物多样性和污染程度。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于环境污染源的追踪和监测。
4. 生物工程：核酸等温扩增技术在生物工程领域也有重要应用。
核酸的体外扩增概述
核酸的体外扩增概述核酸体外扩增，也称为聚合酶链式反应（PCR），是一种重要的分子生物学技术，用于扩增和复制特定DNA或RNA序列。
PCR技术的广泛应用和成功应用于许多领域，例如基因检测、疾病诊断、法医学、基因工程等。
本文将对PCR技术进行概述。
PCR技术的原理是依靠DNA的双链结构，通过循环变性、引物结合和DNA合成三个步骤，实现对特定DNA序列的放大。
这三个步骤分别是变性步骤、退火步骤和延伸步骤。
变性步骤：PCR反应开始时，DNA双链被加热至95°C以上，使两个DNA链分离，并形成两个单链DNA（ssDNA）。
高温对DNA的作用是破坏氢键，导致核苷酸碱基对之间的结合断裂。
退火步骤：PCR反应降温至50°C-60°C，引物（primer）结合到目标DNA的末端，引物是DNA聚合酶所需要的模板以及DNA链延伸的起始点。
延伸步骤：PCR反应在60°C-75°C下进行，加入了一种DNA聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶。
该酶识别引物，并根据引物上的信息开始合成新的DNA链。
在延伸步骤中，引物结合到目标DNA的3'末端，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，通过碱基配对法则，以模板链作为基础合成新的互补链。
这个过程重复多次，每次延伸都以新合成的DNA链的3'末端为起始点，最终在特定的PCR循环中产生大量的复制DNA。
PCR技术可分为传统PCR和实时定量PCR两种方法。
传统PCR是利用热循环PCR仪进行多个PCR循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
由于PCR是在反应管中进行的，所以扩增产物只能通过凝胶电泳进行检测，不能实时监测。
实时定量PCR是在PCR反应中添加一种荧光信标，通过检测荧光信号的强度来实时监测扩增过程。
实时定量PCR具有高效、快速、准确的优点，能够定量测量样本中起始模板的数量。
同时，实时定量PCR还具有多样性，可用于各种样品，包括基因型分析、基因表达分析、病原体检测等。
分子诊断学之核酸扩增技术-荧光定量PCR技术
荧光实时定量PCR技术是1992年Higuchi第 一次报告提出的，当时的标记染料就是EB，检 测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控 PCR反应的进程。
PCR反应的数学函数关系，结合相应的算 法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样 品中的目标基因进行准确定量。
4
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，该技术实现 了PCR从定性到定量的飞跃，克服了常规PCR 技术的诸多问题，为PCR技术进入临床应用打 开了成功之门。 与常规PCR相比，它具有特异 性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度 高等特点，目前已被广泛应用。
不能做多重检测：每孔只能检测一个目标基因 灵敏度低：适合于5000 拷贝以上的基因定量
27
2. 荧光标记探针法
5' 3'
R
Q
5'
3'
3'
5'
14
什么是CT值
荧光信号有统计学意义显著增长（即穿过阈值 线）时的循环次数
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
半对数图谱
CT值
CT值
15
什么是阈值（threshold）
• PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本
底信号
• 荧光阈值是3-15个循 环的荧光信号的标准 偏差的10倍，即： threshold = 10 ´ SDcycle 3-15
N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E： 扩增效率 n: 循环数
9
PCR方程只在指数期成立
线性增长期
平台期
Log [DNA]
指数增长期 y = x(1+e)n
核酸提取及扩增技术简介(含等温扩增技术)-综述
核酸提取及扩增技术原理简介1核酸理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
2细胞破碎大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。
1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
2）化学试剂法：经一定的pH 环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。
而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液（TE、STE 等）提供。
在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA 等）螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。
3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
核酸扩增技术
核酸扩增技术
• Thermocycling based
– PCR (Polymerase Chain Reaction, Roche Diagnostics) • Reverse Transcription-PCR ("RT-PCR") • Pre-Post versus Real-Time PCR • Multiplex PCR • Nested PCR • On-Array-PCR • Digital PCR
• Signal Amplification
第一节 聚合酶链反应
一、PCR的基本原理和反应过程
①变性 Denaturing
Target DNA denaturation
②退火 Annealing ③延伸 Extension
forward primer
primer annealing
Pol
reverse primer
• 退火时间主要取决于引物长度 • 延伸时间主要取决于扩增产物长度，一般1kb/min。 • 200~1000bp的扩增片段，循环中变性、退火和延伸
非特异性扩增。
（一）反应体系:
2.引物（Primer)
设计原则：
• 设在被扩增目的片段的双侧两端，并分别与模板正负链碱 基序列互补。
• 长度以15至30个核苷酸为宜。
Байду номын сангаас
• 两条引物之间（尤其3-OH未端）的序列不能互补。
• 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。 C+G 比例以45%-55%。引物3端尤其要避免重复的CG碱 基序列。
5 ℃。过低易产生非特异性扩增，提高退火温度可提高扩增 的特异性，但也会降低扩增的效率。
细胞核酸技术中的PCR扩增技术
细胞核酸技术中的PCR扩增技术PCR扩增技术是现代分子生物学和遗传学中非常重要的技术之一。
PCR的全称是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种在珂尔基体DNA中复制任何段DNA的技术。
PCR技术是利用核酸酶和DNA聚合酶链式反应的原理，在体外重组DNA分子，大量扩增目标序列DNA的一种技术。
它在医学、科研等领域得到了广泛的应用。
1. PCR的原理PCR技术通过三个步骤完成DNA扩增。
第一步是变性，加热将双链DNA分离成单链DNA。
第二步是连接引物，低温下，引物连接到DNA单链的两端。
第三步是聚合，加入DNA聚合酶、dNTP等反应物，以引物为起始点进行DNA链的合成。
2. PCR在医学应用中的作用PCR技术在医学应用中有着非常重要的作用。
医学诊断领域中，PCR技术可以快速、准确地检测出特定病原体的核酸序列，如肺结核、艾滋病、病毒感染等。
由于PCR技术高灵敏、高特异，减少了传统细菌培养方法出现假阴性的可能，因此在现代医学诊断中得到了广泛的应用。
另外，PCR技术还可以对人类基因进行分析，为个体化医疗和基因治疗提供了技术支持。
3. PCR在基础研究中的应用除了在医学诊断中的应用，PCR技术在基础研究领域中也非常重要。
通过PCR技术可以快速、准确地检测出细胞内、组织内的某种具有研究价值的基因或伴随基因、单核苷酸多态性等。
PCR 技术还可以在DNA序列分析、建立基因库、克隆基因等方面发挥作用。
PCR技术为生命科学研究提供了一种快速、准确的检测手段。
4. PCR技术在食品检测中的应用PCR技术被应用于食品安全领域的检测中，可以快速、高效地检测到食品中存在的病原体和污染物，如大肠杆菌、沙门氏菌、耐药性菌等。
通过PCR技术，可以在食品加工前发现污染，并采取相应的措施，保证食品安全。
5. PCR技术在环境领域中的应用最近几年，PCR技术在环境科学领域的应用越来越多。
PCR技术可以快速、高效地监测环境中的细菌、病毒、微生物等有机体，也可以检测环境中污染物的来源和分布情况，为环境保护提供了一种高效的检测手段。
核酸扩增技术
• 核酸扩增技术概述 • 主要核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术的实验操作流程 • 核酸扩增技术的应用案例
01
核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种分子生物学 技术，通过特定的酶促反应，将 核酸片段在体外进行指数级扩增 ，以便进行后续的检测和分析。
原理
潜在的交叉污染风险
在实验过程中，如果操作不慎或仪器清洁不到位，可能导致交叉污染， 影响实验结果。
成本较高
虽然核酸扩增技术所需仪器设备和试剂已经逐渐标准化，但仍相对较 高，对于一些资源有限的地区和实验室来说可能存在经济压力。
04
核酸扩增技术的实验操作流程
样本处理
01
02
03
样本收集
采集具有代表性的样本， 确保样本质量。
qPCR技术
总结词
实时荧光定量聚合酶链式反应是一种在PCR反应过程中加入荧光标记，通过荧光信号的 积累实时监测PCR进程的技术。
详细描述
qPCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时 监测PCR进程，最后通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。该技术具有高灵敏度、 高特异性和可定量等优点，广泛应用于基因表达分析、突变检测和病毒载量测定等领域。
2000年代以后
随着测序技术的发展，新一代核酸 扩增技术如高通量测序、数字PCR 等逐渐崭露头角，广泛应用于生命 科学、医学等领域。
应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于基因克隆、基因组测序、 基因表达分析等基础研究领域
。
临床诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 感染性疾病、肿瘤等疾病，如 HPV检测、HCV基因分型等
核酸扩增技术
目录
CONTENTS
• 核酸扩增技术概述 • 常用核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的应用 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术实验操作流程
01 核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种通过特定的生物 化学反应，将目标核酸片段在体外进 行快速、特异的复制的技术。
原理
基于DNA或RNA的复制机制，通过使 用引物和特定的酶，将目标核酸片段 进行指数级扩增，从而实现核酸的快 速扩增。
临床意义评估
结合临床样本情况和患者病情，对扩增结果进行解读 ，为临床诊断和治疗提供依据。
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THANKS
历史与发展
01
02
03
1980年代初期
最早的核酸扩增技术问世 ，基于PCR技术。
1990年代
随着技术的不断改进，出 现了多种核酸扩增技术， 如LAMP、TMA等。
21世纪
随着测序技术的发展，新 一代核酸扩增技术如数字 PCR、单分子测序等逐渐 兴起。
技术分类
基于PCR的方法
包括常规PCR、实时荧光定量PCR、数字 PCR等。
可定量
通过扩增过程中的荧光标记或电泳技术，可以确定核酸的相对或绝对 含量，有助于了解病情严重程度和治疗效果。
应用广泛
核酸扩增技术可以应用于各种不同的生物和医学领域，如病毒检测、 细菌鉴定、基因表达分析等。
缺点
易污染
扩增过程中可能出现假阳性结果，主 要原因是扩增产物污染或交叉污染。
高成本
核酸扩增技术需要昂贵的仪器、试剂 和探针，导致检测成本较高。
要点二
肿瘤诊断
通过扩增肿瘤相关基因的表达产物，可以辅助肿瘤的诊断 和预后评估，为肿瘤个体化治疗提供依据。
核酸依赖性扩增技术
详细描述
RCA利用环状DNA模板在滚环复制酶的作用下，通过循环滚环复制实现核酸的扩增。 该技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，常用于检测基因突变和基因差异表
达等研究，同时也可用于合成DNA纳米结构等领域。
03
核酸依赖性扩增技术增技术，可以 快速、准确地克隆特定基因片段 ，为进一步基因功能研究和基因 治疗提供基础。
基因治疗
通过将正常基因导入病变细胞并表达，以达 到治疗疾病的目的。
04
核酸依赖性扩增技术的挑战与 前景
技术局限性
灵敏度与特异性
尽管核酸依赖性扩增技术具有高 灵敏度，但在某些情况下，其特 异性可能受到限制，可能导致假 阳性或假阴性结果。
交叉污染
由于扩增过程中可能出现交叉污 染，导致实验结果出现偏差，因 此需要严格控制实验操作和环境 。
产物检测
通过凝胶电泳、荧光定量PCR 等技术对扩增产物进行检测和
定量分析。
历史与发展
早期发展
核酸依赖性扩增技术最早 可追溯到1980年代初，当 时主要采用多聚酶链式反 应（PCR）技术进行DNA 扩增。
技术改进
随着技术的不断发展，出 现了多种核酸依赖性扩增 技术，如实时荧光定量 PCR、逆转录PCR、巢式 PCR等。
特点
高灵敏度、高特异性、操作简便、检 测快速等。
工作原理
引物设计与合成
根据目标核酸序列设计特异性 引物，通过化学合成或基因重
组技术制备。
模板制备
提取或制备待检测样本中的核 酸，作为扩增反应的模板。
扩增反应
在特定温度和缓冲液条件下， 利用核酸聚合酶催化引物与模 板互补序列的延伸，形成新的 核酸片段。
开发多重核酸依赖性扩增技术，能够同时检测多 个病原体或基因位点，提高检测效率。
核酸扩增的原理和步骤
核酸扩增的原理和步骤1.引言核酸扩增是一种在分子生物学研究中广泛使用的技术，它能够对目标D N A或RN A进行高效、快速的扩增，从而获得足够的样本来进行后续的实验分析。
本文将介绍核酸扩增的原理和步骤，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
2.核酸扩增的原理核酸扩增是通过模拟自然界中的D NA复制过程，利用特定的酶和引物来扩增目标D NA或RN A分子。
其原理主要包括以下几个方面：2.1D N A复制在自然界中，DN A复制是通过DN A聚合酶酶和模板D NA的配对来进行的。
DN A聚合酶在复制过程中沿着DN A链合成新的互补链，从而形成两条完全相同的DN A分子。
2.2反转录和P C R核酸扩增常用的两种方法是反转录和聚合酶链式反应（PC R）。
反转录是将RN A转录成互补的DN A分子，而PC R是通过D NA聚合酶酶和引物的配对来扩增目标D NA。
2.3引物的选择在核酸扩增中，引物是起到识别和定位目标分子序列的作用。
引物通常由20-30个核苷酸组成，它们与目标分子的特定区域互补配对。
通过引物的引导作用，DN A聚合酶能够在目标分子的特定区域进行扩增。
3.核酸扩增的步骤核酸扩增主要包括三个关键步骤：扩增前的预处理、P CR反应和扩增后的分析。
下面将详细介绍每个步骤的操作。
3.1扩增前的预处理在进行P CR反应之前，需要对样本进行一些预处理，以提取目标DN A 或R NA。
常用的预处理方法包括酚/氯仿提取、磁珠法和凝胶切割等。
通过这些方法，可以从样本中获得纯净的目标分子。
3.2P C R反应P C R反应是核酸扩增的核心步骤，需要以下组分：模板DN A或R NA、引物、d NT Ps、缓冲液和Ta qD NA聚合酶。
具体操作步骤如下：1.准备PC R反应体系，将上述组分按比例添加到反应管中；2.启动PC R反应，将反应管置于热循环仪中；3.热循环参数设置，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤；4.热循环数量的确定，通常为25-40个循环；5.PC R反应结束后，可进行扩增产物的检测和分析。
核酸扩增技术
核酸扩增技术的原理及应用_董彦莉
核酸扩增技术的原理及应用董彦莉1 刘 玮2 王晓梅3 周平平1 李晓慧1(1.河北农业大学中兽医学院;2.天津武警医学院化学科研室;3.中国人民解放军军械工程学院理化科研室)[摘 要]本文对核酸扩增的几个方面,即聚合酶链式反应、连接酶链反应和Qβ复制酶技术等这几种技术的原理和用途分别作了介绍。
[关键词]核酸扩增技术 聚合酶链式反应 连接酶链反应 Qβ复制酶技术 最近二、三十年中,现代生物科学迅速发展,其中以重组DN A为中心的基因工程学是最引人注目的新研究领域。
而核酸扩增技术作为基因工程学上重要的一个组成部分,不仅可以扩增和分离目的基因,并且在临床医疗诊断、基因突变监测和分子进化等方面也有重要用途。
核酸扩增包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链反应(L CR)和Qβ复制酶技术等,本文对这几种技术的原理和应用分别作了介绍。
1聚合酶链式反应1.1基本原理PCR技术是在模板DN A、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下,依赖于耐高温的DN A聚合酶的酶促合成反应。
PCR以欲扩增的DN A作为模板,以模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物,经过模板DN A变性、模板引物复性结合,并在DN A聚合酶作用下发生引物链延伸反映,来合成新的模板DN A。
每一循环的DN A产物经变性又成为下一个循环的模板DN A。
这样,目的DN A数量将以2n-2n形式累积,在2h内可扩增30(n)个循环,DN A量达原来的上百万倍。
扩增产物通过凝胶电泳、So uthern杂交或DN A序列分析进行检测。
PCR可扩增双链DN A和单链RN A,并能以RN A为模板,进行反转录PCR(RT-PCR)以扩增cDN A。
此技术由于其灵敏度高、特异性好、能够区别强弱毒株,在传染病的诊断和流行病学普查方面颇具潜力。
方法是在PCR体系中先引入反转录酶,将RN A反转录获得c DN A,再以c DN A作为PCR的模板,加入引物和T aqDN A聚合酶,按正常PCR方式扩增cDN A。
分子诊断学之核酸扩增技术-聚合酶链反应技术
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CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
一、 聚合酶链反应技术
polymerase chain reaction，PCR
（一）PCR技术发展简史 （二）PCR技术原理 （三）PCR反应体系、条件及其优化 （四）扩增产物检测及分析 （五）PCR常见问题与原因分析 （六）PCR衍生技术
1
概念
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR ） 是 指 在 DNA 聚 合 酶 催 化 下 ， 以 母 链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通 过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出 与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是DNA体外合成放大技术，能快速特异地 在体外扩增任何目的DNA。
2
（一）PCR技术发展简史
1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结 构及半保留复制模型。
1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。
70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
3
1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺 贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合 适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不 断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因：
核酸扩增的原理
核酸扩增的原理核酸扩增是一种重要的分子生物学技术，用于在体外复制DNA或RNA的方法。
它是通过扩增目标序列的DNA或RNA分子量来分析其结构和功能，也是生物学研究、遗传病诊断、DNA指纹鉴定等领域的基础技术。
核酸扩增的原理主要包括选择适当的扩增方法、设计引物、选择适当的酶和酶的特性、反应条件的优化等。
核酸扩增的方法有多种，其中最常用的是聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，它可以迅速复制少量DNA片段，从而在实验室中产生大量可用于分析的DNA。
PCR反应基于DNA的链式扩增原理，包括三个主要步骤：变性、引物结合和扩增。
变性是PCR反应的第一步，它是将DNA模板中的双链DNA分离为单链DNA 的过程。
这一步通过在高温下使DNA解离来实现。
当反应混合物中的DNA模板处于高温时，双链DNA的氢键会断裂，分离成两条单链DNA。
在扩增中，通常需要将反应混合物加热至94-98摄氏度。
引物结合是PCR反应的第二步，它是使引物与目标序列特异性结合的过程。
在这一步中，反应混合物降温，使引物与目标序列互补配对。
引物通常是由DNA 合成的寡核苷酸，具有与目标序列末端互补的核酸碱基序列。
一条引物是朝一个特定方向扩增目标序列的，而另一条引物是朝相反方向扩增目标序列的。
扩增是PCR反应的第三步，它是通过DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链的过程。
在这一步中，反应混合物升温至DNA聚合酶的最适温度（通常为55-72摄氏度），以使酶能够在引物的引导下合成新的DNA链。
DNA聚合酶首先会结合到引物的末端，然后向引物的反向方向移动，并合成与目标DNA 互补的新的DNA链。
这个过程会在每一轮循环中重复，每一轮都会产生新的DNA链。
PCR反应循环通常包括变性、引物结合和扩增三个步骤，并在一个反应体系中进行多次循环。
每一轮循环将产生两倍数量的目标DNA序列。
经过多轮循环后，PCR反应可以迅速产生高浓度的目标DNA序列。
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基 本
N= N0(1+E)c
原
理
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PCR反应体系、条件及其优化
n PCR反应体系
引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必 要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在 人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ). 而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有 1/400个.
较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序 列或者使用于产生一些突变位点
模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase)
dNTP PCR缓冲液（PCR buffer）
n PCR反应条件
变性 退火 延伸 循环
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模板（template ）
DNA
基因组DNA
RNA：总R质粒NDAN、A mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA
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引物（primers)
n 引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数， 从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有 的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
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GC含量太高也易于引发非特异扩增。
同一碱基连续出现不应超过5个
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引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
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碱基分布的均衡性
GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。 上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火 温度不利于提高PCR的特异性
→ Sense primer
3’ 5’
5’
← 3’
Antisense primer
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引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地 位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异 结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的 灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效 的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密 切相关。
引物设计一般原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
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引物长度
一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段 PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超 过50个核苷酸。
一、 PCR技术发展简史 二、 PCR技术原理 三、 PCR反应体系、条件及其优化 四、扩增产物检测及分析 五、 PCR常见问题与原因分析 六、PCR衍生技术
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PCR技术发展简史
Korana于1971年最早提出核酸 体外扩增的设想。
1985年Mullis等发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1993年诺贝尔化学奖获得者)
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PCR技术发展简史
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得
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引物设计总原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹
结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
应(即错配)。
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主要内容
第一节 聚合酶链反应技术 第二节 荧光定量PCR技术 第三节 其他核酸扩增技术 第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制
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第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR
引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基 互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严 重影响DNA聚合酶的延伸。
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引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需 严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’ 端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不 要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误 引发机率增加。