实时荧光等温扩增技术
传染性造血器官坏死病毒(IHNV)实时荧光环介导等温扩增快速检测方法的建立
显 示 出良好 的扩增效 率。以 Ｅ Ｓ Ｅ ． Ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｔ ｕ ｂ ｅ ｓ ｃ ａ ｎ ｎ ｅ ｒ为恒温反应及检 测平 台，对 Ｉ Ｈ ＮＶ进行 实时荧光检 测，反应 在４ ０ ｍｉ ｎ内可得 出结果 。本研 究建立 的 Ｉ Ｈ ＮＶ 实时 荧光 Ｌ Ａ ＭＰ法检 测限达到 ３ ． ６ Ｐ ｇ 。特异性试验表 明仅 Ｉ Ｈ ＮＶ 发 生特异性扩 增 ，而 Ｓ ＶＣ Ｖ、Ｖ ＨＳ Ｖ、ＨＲ Ｖ、Ｐ Ｆ Ｒ Ｖ 以及 Ｉ Ｐ Ｎ Ｖ 均不发生反应 。所建立 的恒温 实时荧光检 测法操 作 简单 、反 应迅速 ，同时具有较 高的灵敏度 和特异性 。引入 的 Ｅ Ｓ Ｅ — Ｑｕ ａ ｎ ｔ ｕｂ ｔ ｅ ｓ ｃ ａ ｎ ｎ ｅ ｒ 平 台设备要 求低 ，同时使
Ｂｉ ｏ — ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｃｏ ． ， Ｌ ｔ ｄ ． Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ５１ ０ ０ １ ２ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｙ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｄ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ・ ｔ ｉ ｍｅ ｌ ｏ ｏ ｐ — ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍａ ｌ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ （ ＬＡＭ Ｐ） ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ ｈ ｅ ｍａ ｔ ｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｃ ｎ ｅ ｃ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ （ Ｉ ＨＮＶ） ． Ｔｈ ｒ ｅ ｅ ｓ ｅ ｔ ｓ ｏ ｆ ＬＡＭ Ｐ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｗｅ ｒ ｅ
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光核酸恒温扩增技术在肺结核诊断中的价值分析
２ ０ １ ５年 ８月 第２ ０卷 第 ８期
１ ４ ８ ７
实时 荧光 核 酸 恒 温 扩 增 技术 在 肺 结核 诊 断 中的价 值分 析
许光辉
【 摘要 】 目的
赵柳婵 陈华
黄 粜 德 陈 志 宇 刘 治 忠
纳入 １ １ ２ １
评价实时荧光核酸恒温扩增 技术 （ Ｓ Ａ Ｔ — Ｔ Ｂ ） 在肺结 核诊断 中 的价值 。方法
Ｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｃ ｕ ｌ ｏ ｓ ｉ ｓ Ｐｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ，Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｍｅ ｎ，Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ５ ２ ９ ０ ０ ０，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
【 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】 ０ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｖ ｌ ａ ｕ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ｖ ａ ｌ ｕ ｅ ｏ ｆ ｓ ｉ ｍ ｕ ｌ ｔ ａ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓ ａ ｍ ｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ（ Ｓ Ａ Ｔ － Ｔ Ｂ ）
断 中是 一 种 快 速 、 准确 、 敏感的方法 ， 值得推 广。
Ｓ Ａ Ｔ － Ｔ Ｂ法在肺 结核 的早期诊
【 关键词 】 实 时荧光 核酸恒温扩增 ； 结核／ 肺； 结核分枝杆菌 ； 痰涂片 ； 痰培养
Ｄｉ ａ ｇｎｏ ｓ ｉｃ ｔ ｖａ ｌ ｕｅ ｏ ｆ ｓ ｉ ｍ ｕｌ ｔ ａｎｅ ｏｕ ｓ ａ ｍ ｐｌ ｆｃ ｉ ａｔ ｉｏｎ ａ ｎｄ ｔ ｅ ｓ ｉｎｇ ｔ ｉ ｎ ｐａ ｉｅ ｔ ｎｔ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｐｕ ｌ ｍ ｏｎ ａｒ ｙ ｔ ｕｂ ｅ ｒ ｃ ｌｏ ｕ ｓ ｉ ｓ ＸＵ
等温扩增是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！
等温扩增是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，等温扩增技术便是其中一种，与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。
相信以等温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一，二十年的方向。
本文总结了目前常见的等温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。
同时对PCR和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）是利用耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶），将模板DNA，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液等在不同温度间循环，从而达到双链DNA分离，引物粘合到模板上的互补区间，最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA 链上的过程。
PCR是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
环介导等温扩增 (LAMP )环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3`末端末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光等温多自配引发扩增技术检测深圳市手足口病肠道病毒71型评价
关键 词
手足 口病 ； 肠 道病毒 ７ １型 ： 实时 荧光 等温 多 自配 引发扩增技 术
Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ０ ｆ ＥＶ７ １ ｉ ｎ ｈ ａ ｎ ｄ－ ｒ ０ ０ ｔ － ｍｏ ｕ ｔ ｈ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ａ ｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍｅ ｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ
ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｔ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｍ ｆ ｒ ｏ ｍ ２ ０１ ４ ｔ ｏ ２ ０１ ５ ．Ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ７ １ ｗａ ｓ ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍｅ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ＲＴ － Ｉ ＭＳ Ａ，ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ
检测。 为 手 足 口病 的 综合 防 治 和 动 态 监 测 提 供 手 段 和 依 据 。 方 法 ： 随机 选取 ２ ０ １ ４年 １ — １ ２月深 圳 市哨 点 医 院 手 足 口病 确 诊 患 者 轻 症 １ ５ ６例 ， 重症 ８ ４例 ， 运 用 荧光 Ｒ Ｔ — Ｉ ＭＳ Ａ技 术 检 测 患 者 样 本 Ｅ Ｖ ７ １ ， 描述 Ｅ Ｖ ７ １ 的 流
实用 医学杂 志 ２ ０ １ ６ 年第 ３ ２ 卷第 ２ ４期
４ １ １ ｌ
・
检 验 与 临 床 ・
实 时荧光 等温 多 自配 引发扩增技术检 测深圳 市 手足 口病 肠道病 毒 ７ １ 型评价
吴 明 王 凯 风 张 婷 尹 丹 唐 时 幸 胡 贵 方
摘要 目的 ： 应 用 实时 荧光 等温 多 自配 引发扩增技 术 （ 荧光 Ｒ Ｔ — Ｉ ＭＳ Ａ） 实现肠 道病毒 ７ １型（ Ｅ Ｖ ７ １ ） 快速
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光恒温扩增技术实验流程
实时荧光恒温扩增技术实验流程实时荧光恒温扩增技术是一种常见的分子生物学实验技术，常用
于检测DNA序列的扩增、定量和分析。
其实验流程大致如下：
1. 样品制备：将待分析的DNA样品获取并纯化，通常采用常规的
提取方法，如血液、组织、细胞等。
2. 扩增反应体系：制备PCR反应混合液，包括DNA模板、引物
（一对）和扩增酶等，其中引物的设计及选择需根据具体实验需要。
3. 反应条件设定：设定反应的温度和时间等参数，如反应温度通
常设在60-65°C左右，时间取决于扩增片段的长度和PCR反应的效率。
4. 实时监测反应：在恒温扩增仪中，根据反应体系的不同，选择
合适的荧光染料，实时监测扩增过程，可得到扩增曲线，确定扩增产
物的数量和质量等信息。
5. 数据分析：根据实时监测得到的扩增曲线，可利用软件对扩增
产物的数量、含量进行定量和分析，比如利用常用的标准曲线法等方法。
总之，实时荧光恒温扩增技术是一种高效、快速、灵敏的分子生
物学实验技术，可广泛应用于医学、生物学等领域，为许多研究提供
了有力的工具。
实时荧光核酸恒温扩增技术在妇女生殖道病原体感染诊断中的应用价值
实时荧光核酸恒温扩增技术在妇女生殖道病原体感染诊断中的应用价值摘要】目的：分析实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在妇女生殖道病原体感染诊断中的应用价值。
方法：我院2015年1月至2017年12月疑似生殖道病原体感染的女性患者200例为研究对象，分别采取免疫层析胶体金检测法、SAT比较沙眼衣原体（CT）的阳性检出率。
采用培养法和SAT比较解脲支原体（UU）的阳性检出率，采用SAT检测生殖支原体（MG）的阳性率。
结果：在CT检测中SAT的阳性率为6%，胶体金阳性率为4%，经卡方检验，χ2=0.01,P>0.05差异无统计学意义。
对4份SAT阳性而胶体金阴性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果：4份均为阳性。
在UU检测中SAT的阳性率为35.5%，培养法阳性率为30.0%，经卡方检验，χ2=0.01,P>0.05差异无统计学意义。
对4份培养阳性而SAT阴性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果1份为阳性，3份为阴性；对15份培养阴性而SAT阳性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果14份为阳性，1份为阴性。
SAT检测MG的阳性率为3.5%（7/200）。
结论：培养法是UU检测的临床金标准，然而却存在一定的不足之处，如费时、操作繁琐、敏感性低等，更需要进一步确认。
胶体金法检测CT则耗时较长，且检测工艺较为繁琐。
采用SAT检测女性生殖道沙眼衣原体、解脲支原体、生殖支原体具有较好的应用效果，检测时间短、成本低，在临床可作为病原体感染判断依据。
【关键词】实时荧光核酸恒温扩增技术；病原体感染；生殖道【中图分类号】R711 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）30-0126-02解脲支原体（UU）、沙眼衣原体（CT）、与生殖支原体（MG）为临床中泌尿生殖道疾病的常见致病病原体，正确的诊断疾病的感染类型，实施针对性治疗是对抗女性生殖道病原体感染疾病的重要途径[1]。
以往采取培养法检测，但现有研究提出SAT在病原体诊断中具有更好的效果，敏感度更高[2]，为进一步探索SAT在CT、UU、MG 3种病原体感染中的诊断价值，本研究将SAT与其他检测方法进行对比，获得一些收获，现将本研究报道如下：1.资料与方法1.1 一般资料我院2015年1月至2017年12月女性患者共200例为研究对象。
在实验室检测核酸的方法
在实验室检测核酸的方法
实验室中常用的检测核酸的方法有以下几种：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的核酸检测技术，主要用于扩增目标DNA序列。
通过PCR可以在短时间内扩增出大量目标DNA，使其能够被进一步分析和检测。
2. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR结合了PCR和荧光探针技术，可以在PCR的同时进行定量检测。
通过检测PCR反应过程中荧光信号的强度，可以实时监测并定量目标核酸的数量。
3. 等温扩增：等温扩增是一种在常温或接近常温下进行的核酸扩增方法。
常用的等温扩增方法包括LAMP（循环介导等温扩增）和RPA（递归螺旋扩增）等。
等温扩增技术具有快速、敏感、简便等特点。
4. 测序技术：测序技术是一种用于确定核酸序列的方法。
常用的核酸测序技术包括Sanger测序和新一代测序技术（如Illumina测序、Ion Torrent测序等）。
这些技术可以通过对目标核酸序列进行测序，实现对其序列信息的分析和检测。
5. Northern blot：Northern blot是一种利用电泳分离和检测RNA的方法。
通过将RNA样品经过电泳分离后，利用亲和性探针进行靶向检测，可以确定目标RNA在样品中的存在和相对数量。
这些方法在实验室中广泛应用于核酸的检测和分析，并且可以根据具体需求进行选择和组合使用。
实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果
实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果发布时间：2021-10-11T05:24:15.816Z 来源：《医师在线》2021年12期作者：罗朝霞[导读] 探讨分析实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果。
罗朝霞（赣州市人民医院；江西赣州341000）摘要：目的：探讨分析实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果。
方法：此次研究，选择我院之中，收诊接受生殖道支原体感染检测的200例患者，2019年2月-2021年2月，均采取实时荧光核酸恒温扩增技术检测，并对检测结果进行分析。
结果：男性检测阳性率，高于女性（P＜0.05）；年龄≤20岁患者阳性率最高，随着年龄增加患者感染率降低（P＜0.05）。
结论：实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的价值较高，受到患者性别、年龄影响，临床价值明显。
关键词：泌尿生殖道；实时荧光核酸恒温扩增技术；生殖支原体生殖支原体是人类和动物体内必须存在的一种极其微小的寄生微生物。
它可以复制和繁殖自己。
生殖道支原体感染可引起多种泌尿系统疾病，包括前列腺炎、宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、尿道炎以及男女不育症。
由于生殖道支原体离体培养环境要求高，适合在37℃左右的厌氧培养皿中生活[1]。
如果培养皿中的环境不满足生殖支原体的繁殖生长，则其组合缺乏特异性和敏感性。
实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测是一种将实时荧光检测与核酸恒温扩增相结合的检测方法。
该方法具有灵敏度高、特异性强的优点。
广泛应用于泌尿生殖道、呼吸道病原体和肠道病毒的检测[2]。
本次研究，主要针对实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果进行调查和研究。
详细内容见下文：1、资料与方法1.1一般资料此次研究，选择我院之中，收诊接受生殖道支原体感染检测的200例患者，2019年2月-2021年2月；男性100例，女性100例，年龄范围在18岁~60岁之间，平均年龄为（37.25±3.82）岁；患者在参与研究之前，需进行基础资料登记，以及数据统计，P＞ 0.05。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术在胸腔积液结核分枝杆菌检测中的应用
实时荧光核酸恒温扩增检测技术在胸腔积液结核分枝杆菌检测中的应用成松;刘成永;周冬青;侯远沛【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2015(000)018【摘要】目的：评估采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT ）快速检测结核性胸膜炎患者胸腔积液中的结核分枝杆菌（MTB ）的临床应用价值。
方法收集90例确诊结核性胸膜炎患者胸腔积液标本和52例非结核性胸膜炎患者胸腔积液标本，分别采用罗氏培养法、SAT和DNA荧光定量扩增法检测MTB ，并通过与罗氏培养法比较，分析SAT的灵敏度、特异度及临床应用价值。
结果以罗氏培养法为标准，则SAT的灵敏度、特异度和约登指数分别为90．9％、72．1％、0．630。
在临床确诊的结核性胸膜炎患者中，罗氏培养法和SAT检测胸腔积液标本的阳性检出率分别为24．4％、43．3％，差异有统计学意义（χ2＝7．1663，P＝0．0014）。
结论 SAT检测胸腔积液标本中的MTB ，具有快速、灵敏度和特异度较高的优点，可提高胸腔积液标本中MTB的检出率并减少误诊和漏诊的发生。
【总页数】3页(P2697-2698,2701)【作者】成松;刘成永;周冬青;侯远沛【作者单位】江苏省徐州市传染病医院检验科，江苏徐州200433;江苏省徐州市传染病医院检验科，江苏徐州200433;江苏省徐州市传染病医院检验科，江苏徐州200433;江苏省徐州市传染病医院检验科，江苏徐州200433【正文语种】中文【相关文献】1.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在继发性肺结核患者中的应用价值 [J], 侯艳杰;房宏霞;蔚鸣;闫朋;许雪薇;许鑫鑫;张宝庆;刘春涛;刘玉琴2.RNA恒温扩增实时荧光检测技术在检测脑脊液中结核分枝杆菌的应用 [J], 张海晴;黄海滨;王春颖;刘成永;胡永领;侯远沛;成松;周冬青3.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童肺炎支原体肺炎治疗中的应用研究 [J], 牛春密;梁航;刘丽;赵靖;徐淑凤4.实时荧光核酸恒温扩增检测技术对痰标本中结核分枝杆菌的诊断价值 [J], 柴国祥;李兴芳;韩斌孝;王磊;杨永红;章国平;牛晨霞5.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术在脊柱结核检测中的应用 [J], 王新刚;卫建民;杨俊松;王自立;冯万立;夏斌;吕会强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
核酸等温扩增(1)
基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温 核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型 探针互补的重复序列。
RCA反应体系组成： 噬菌体 φ29DNA 聚合酶、单链环状 DNA 模板和引物
（一条或一对也可多条）。 噬菌体 φ29 DNA 聚合酶具备很强的链置换活性，无需模 板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成 DNA。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆 等基因工程操作。
精品课件
17
精品课件
18
精品课件
19
精品课件
20
精品课件
21
精品课件
22
NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
RPA技术的缺点
严格专利保护 反应成分复杂 对临床标本的检测效果较差
精品课件
44
谢谢
精品课件
45
该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在 我国的应用限制，使其更好地服务于我国的 传染病防控、食品安全检测和环境物种保护 等各个领域。
精品课件
35
RPA技术
精品课件
36
RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年 由剑桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
精品课件
26
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
实时荧光核酸恒温扩增技术在解脲脲原体检测中的应用
血４ ｍＬ ， 注 入 ２支 试 管 中 ， １ 支试管加入肝素抗凝剂 ， １支试 管 未加入肝素抗凝剂 ， 每支 ２ ｍＬ， 分别进 行各项 生化指标 检测 ， 结果显示 ， 血浆 、 血清 中 Ｃ Ｏ 、 Ｋ、 Ｔ Ｐ生 化 指 标 检 测 结 果 比 较 差 异有统 计学 意义 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ； 血浆 、 血清 中 Ｇ Ｌ Ｕ、 ＵＡ、 ＡＬ Ｔ、
［ ８ ］ 薛乐 ， 高明惠． 肝 素 抗 凝 血 浆 用 于 检 测 十 项 酶 活 力 生 化 指
标可 行 性 分析 ［ Ｊ ］ ． 延安 大 学 学 报 （ 医学科学 版） ， ２ ０ １ ２ ， １ ０
（ ２ ） ： ５ ６ － ５ ７ ．
综上所述 ， 在 急 诊 患 者 生 化 检 验 中应 用 肝 素 抗 凝 血 浆 取 代 传统 的 血 清 ， 不 仅 可 以缩 短 检 验 时 间 ， 有 助 于 急 诊 患 者 的 早 期
［ ９ ］ 宋庆欣． 肝素抗凝血 浆在 急诊 生化检 验 中的应 用 ［ Ｊ ］ ． 北
方药学 ， ２ ０ １ ４ ， １ １ （ １ ０ ） ： １ ８ ３ － １ ８ ４ ．
［ １ Ｏ ］高 艳 飞 ． 探 讨 肝 素 抗 凝 血 浆 用 于 急 诊 生 化 检 验 的 可 行 性
［ Ｊ ］ ． 中 国伤 残 医 学 ， ２ ０ １ ４ ， ２ ２ （ ９ ） ： ２ ０ ８ — ２ ０ ９ ．
（ 收稿 日期 ： ２ ０ １ ６ － ０ ６ — ０ ９ 修 回 日期 ： ２ ０ １ ６ — ０ ８ — ２ ９ ）
参 考 文 献
［ １ ］ 徐震 ， 吴继华 ， 钮 丽萍 ， 等． 肝素 抗 凝 血 浆 用 于 生 化 检 验 的
实时荧光等温扩增技术
60℃2小时 (LA-200) 40cycles
条件同上
阳性对照组（含有待测基因的拷贝数已知的质粒）
临床样本
浊度 亮度
阳性样本
阴性样本
含待测基因的 质粒阳性对照
应用
LAMP 法已经被广泛应用于动物胚胎性别 鉴定，人、动物和植物致病微生物以及寄生 虫的检测，转基因食品，疾病基因诊断，环 境监测食品卫生检疫及基因芯片的开发。
RT-LAMP不会受到提取RNA过程中的污染 物的限制，该文献提示现行的核酸提取方法 过于复杂，需要开发更简单的程序。
疟原虫的检测
在该文献中，研究者直接将50uL的血液在99℃加热十 分钟，然后吸取2uL上清液直接做LAMP 。为了验证这种 方法，研究者又提取这些样本的DNA，并进行了PCR。
PCR(DNA提 LAMP（裂 sensitivity
环介导等温扩增技术(LAMP)
学生： 罗乐 指导老师：聂凯老师
2000年，日本学者Notomi 等发明了一种全新的 核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal ampபைடு நூலகம்ification ，LAMP)。该法能在等温条 件下高特异，高灵敏的扩增DNA。其特点是针对靶 基因的六个区域设计4种特异性引物，利用一种链 置换DNA聚合酶在等温条件（65℃左右）保温一小 时，即可完成核酸扩增反应。
RNA模板：只需在里面加入逆转录酶即可反应。
RT-LAMP扩增FMDV结果的检测方法
LAMP能扩增1-10个拷贝的起始模板浓度 ；RT-LAMP的灵敏度比end-point RT-PCR高10 倍，比常规RT-PCR高10-100倍。从反应速度来 看，RT-LAMP胜过于TaqMan-RT-PCR,而且利用 将96孔板放在实时热循环仪上操作，可以实 现样本的高通量检测。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
引物设计
Primer Explorer version 4.0 软件
扩增机制
1.循环扩增始发物的形成
2.循环延伸
操作程序
DNA模板：首先将模板DNA、引物、dNTP 和缓
冲液按比例配制, 混匀后置95℃中5min( 参与反应
的模板仍然是未变性的DNA) ; 然后冰浴5～10min
退火; 而后加入适量的BstDNA 聚合酶, 于60℃～
疟原虫的检测
在该文献中，研究者直接将50uL的血液在99℃加热十 分钟，然后吸取2uL上清液直接做LAMP 。为了验证这种 方法，研究者又提取这些样本的DNA，并进行了PCR。
PCR(DNA提 取物) 101(+)
101(-)
ห้องสมุดไป่ตู้
LAMP（裂 sensitivity 解上清液） specificity 96(+) 95%
环介导等温扩增技术(LAMP)
学生： 罗乐
指导老师：聂凯老师
2000年，日本学者Notomi 等发明了一种全新的 核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ，LAMP)。该法能在等温条 件下高特异，高灵敏的扩增DNA。其特点是针对靶 基因的六个区域设计4种特异性引物，利用一种链 置换DNA聚合酶在等温条件（65℃左右）保温一小 时，即可完成核酸扩增反应。
65℃反应, 移至80℃热浴10min 终止反应。
RNA模板：只需在里面加入逆转录酶即可反应。
RT-LAMP扩增FMDV结果的检测方法
LAMP能扩增1-10个拷贝的起始模板浓度 ；RT-LAMP的灵敏度比end-point RT-PCR高10 倍，比常规RT-PCR高10-100倍。从反应速度来 看，RT-LAMP胜过于TaqMan-RT-PCR,而且利用 将96孔板放在实时热循环仪上操作，可以实 现样本的高通量检测。 RT-LAMP不会受到提取RNA过程中的污染 物的限制，该文献提示现行的核酸提取方法 过于复杂，需要开发更简单的程序。
阳性对照组（含有待测基因的拷贝数已知的质粒） 60℃2小时
(LA-200) 浊度 40cycles 亮度
临床样本 条件同上
阳性样本
阴性样本
含待测基因的 质粒阳性对照
应用
LAMP 法已经被广泛应用于动物胚胎性别 鉴定，人、动物和植物致病微生物以及寄生 虫的检测，转基因食品，疾病基因诊断，环 境监测食品卫生检疫及基因芯片的开发。
100(-) 99%
LAMP(裂解上 清液) 13（+）
PCR（裂解上 清液 7（+）
PCR（DNA提 取物 13（+）
因此，LAMP不需要抽提纯化DNA就可以进行DNA的高效扩 增，它明显的降低了成本和循环时间;而且LAMP具有较强的 抗干扰能力，可能是由于Bst DNA Polymerase的缘故。
现在日本Eiken公司网站www．eiken．co．jp／en／ index．html已经开发了包括禽流感、SARS、西尼罗河病 毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP检测产品试剂盒出售 国内也报道研制出沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆 菌O157等的快速检测试剂盒。