核酸体外扩增技术综述
PCR技术简介
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
PCR技术综述
PCR技术综述08检二陈勇0803010049PCR技术综述聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。
能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。
PCR技术的展简史1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。
1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。
1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow 片段。
但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。
由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。
PCR扩增
PCR扩增PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。
使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。
PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、槽式P CR、RAPf)、ARDRA等。
RT-PCR不仅能检测出不能培养微生物，还能测量mRNA基因的转录水平。
竞争性PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。
将PCR技术和限制酶切技术结合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR扩增产物，通过对酶切产物的分析，探测该基因的多态性。
RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是应用比较广泛的一项技术。
RAPD是用那些对某—特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。
RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。
用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性。
PCR反应常见问题汇总1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
核酸的体外扩增概述
核酸的体外扩增概述核酸体外扩增，也称为聚合酶链式反应（PCR），是一种重要的分子生物学技术，用于扩增和复制特定DNA或RNA序列。
PCR技术的广泛应用和成功应用于许多领域，例如基因检测、疾病诊断、法医学、基因工程等。
本文将对PCR技术进行概述。
PCR技术的原理是依靠DNA的双链结构，通过循环变性、引物结合和DNA合成三个步骤，实现对特定DNA序列的放大。
这三个步骤分别是变性步骤、退火步骤和延伸步骤。
变性步骤：PCR反应开始时，DNA双链被加热至95°C以上，使两个DNA链分离，并形成两个单链DNA（ssDNA）。
高温对DNA的作用是破坏氢键，导致核苷酸碱基对之间的结合断裂。
退火步骤：PCR反应降温至50°C-60°C，引物（primer）结合到目标DNA的末端，引物是DNA聚合酶所需要的模板以及DNA链延伸的起始点。
延伸步骤：PCR反应在60°C-75°C下进行，加入了一种DNA聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶。
该酶识别引物，并根据引物上的信息开始合成新的DNA链。
在延伸步骤中，引物结合到目标DNA的3'末端，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，通过碱基配对法则，以模板链作为基础合成新的互补链。
这个过程重复多次，每次延伸都以新合成的DNA链的3'末端为起始点，最终在特定的PCR循环中产生大量的复制DNA。
PCR技术可分为传统PCR和实时定量PCR两种方法。
传统PCR是利用热循环PCR仪进行多个PCR循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
由于PCR是在反应管中进行的，所以扩增产物只能通过凝胶电泳进行检测，不能实时监测。
实时定量PCR是在PCR反应中添加一种荧光信标，通过检测荧光信号的强度来实时监测扩增过程。
实时定量PCR具有高效、快速、准确的优点，能够定量测量样本中起始模板的数量。
同时，实时定量PCR还具有多样性，可用于各种样品，包括基因型分析、基因表达分析、病原体检测等。
核酸扩增技术教学课件ppt
RT-PCR技术
总结词
转录、反转录、灵敏度高。
详细描述
RT-PCR技术是一种将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的方法，具有高 灵敏度、高特异性、简单易行等特点，常用于检测细胞中基因表达水平。
qPCR技术
总结词
定量、高灵敏度、实时监测。
详细描述
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术，是一种对特定DNA片段进行实时定量检测 的方法，具有高灵敏度、高特异性、可实时监测等特点，已广泛应用于基因表达 分析、病原体检测等领域。
详细介绍qPCR反应所需的各个组分及其作用，如 模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染 料或探针等。
qPCR数据分析
介绍qPCR实验数据应该如何进行分析，包括扩增 曲线和熔解曲线的绘制和分析，以及Ct值的计算 和应用。
04
核酸扩增技术的数据分析与解读
数据分析方法与技巧
描述性统计分析
对实验数据进行描述性统计，如均 值、标准差等，以了解数据的集中 趋势和离散程度。
通过检测特定基因的扩增或缺失，对疾病进 行诊断和预测。
生物制药
进化研究
利用核酸扩增技术生产重组蛋白、抗体等生 物药物，用于治疗和预防疾病。
研究物种间的基因序列差异，揭示物种进化 的历史和机制。
误差分析与质量控制
01
误差来源
分析核酸扩增技术的误差来源，如试剂质量、操作流程、仪器设备等
。
02
质量控制
制定质量控制标准，如重复实验、阳性对照等，以确保实验结果的准
2023
《核酸扩增技术教学课件 ppt》
目 录
Байду номын сангаас
• 核酸扩增技术概述 • 核酸扩增技术的种类与特点 • 核酸扩增技术实验方案与步骤 • 核酸扩增技术的数据分析与解读 • 核酸扩增技术的优化与改进建议 • 核酸扩增技术的未来发展趋势与展望
核酸体外扩增
交链 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引
物为起始点的延伸反应
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PCR的基本原理 示意图
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二、PCR引物设计原则
在PCR反应中使用的耐热Taq（或其他）DNA聚合酶， 相应的缓冲体系及dNTP（核苷三磷酸）已经商品化，可从 相应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人 员准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后 讨论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核 苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。
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核酸体内扩增和核酸体外扩增
1、
体内DNA复制
体外酶促基因（DNA）扩增
（1）模板
ds→ss
ds→（热变性）ss
（2）酶
DDDP（II）
耐热的Taq酶
有3’ → 5’外切酶活性
有5’ → 3’外切酶活性
5’ → 3’ 外切酶活性
无3’→ 5’ 外切酶活性
（3）引物
RNA
反之b为
下游引物 5‘端引物 正义引物 右侧引物 向后合成引物
3、为什么要进行PCR？
为了获得基因诊断的材料。进行基因定量（表达异常）和 进行基因定性（结构异常）以及获取研究的材料。
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第一节 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction ,PCR)
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PCR是3个反应的有序组合和循环：
1、（高温）变性（94℃）（denaturation）----在摩尔数大大过量 的两段寡核苷酸及4种dNTP参入下，对模板DNA进行加热变性，通过加 热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离形成单链DNA。（denaturation）。
dna体外扩增技术总结
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目的的获取及体外扩增技术概述在基因的研究及体外人工复制过程中，我们通常把需要研究的基因称为目的基因。
基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达，常用的有PCR法、cDNA法及建立基因文库等。
1.PCR法技术及原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
它是一种体外酶促合成，扩增特定 DNA片段的方法。
1985年由美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。
随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。
PCR技术模拟DNA的天然复制过程，基于DNA的半保留复制原理，其特异性依赖于与靶两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：变性——退火——延伸。
变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。
退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。
在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。
延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。
经重复循环变性——退火——延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
核酸体外扩增技术综述
核酸体外扩增技术研究进展摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。
核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。
随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。
就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。
关键词核酸体外扩增聚合酶链式反应（PCR）等温扩增核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。
核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。
核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。
而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。
一、聚合酶链式反应(PCR)PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。
聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。
近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。
已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。
核酸扩增技术
• 核酸扩增技术概述 • 主要核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术的实验操作流程 • 核酸扩增技术的应用案例
01
核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种分子生物学 技术，通过特定的酶促反应，将 核酸片段在体外进行指数级扩增 ，以便进行后续的检测和分析。
原理
潜在的交叉污染风险
在实验过程中，如果操作不慎或仪器清洁不到位，可能导致交叉污染， 影响实验结果。
成本较高
虽然核酸扩增技术所需仪器设备和试剂已经逐渐标准化，但仍相对较 高，对于一些资源有限的地区和实验室来说可能存在经济压力。
04
核酸扩增技术的实验操作流程
样本处理
01
02
03
样本收集
采集具有代表性的样本， 确保样本质量。
qPCR技术
总结词
实时荧光定量聚合酶链式反应是一种在PCR反应过程中加入荧光标记，通过荧光信号的 积累实时监测PCR进程的技术。
详细描述
qPCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时 监测PCR进程，最后通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。该技术具有高灵敏度、 高特异性和可定量等优点，广泛应用于基因表达分析、突变检测和病毒载量测定等领域。
2000年代以后
随着测序技术的发展，新一代核酸 扩增技术如高通量测序、数字PCR 等逐渐崭露头角，广泛应用于生命 科学、医学等领域。
应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于基因克隆、基因组测序、 基因表达分析等基础研究领域
。
临床诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 感染性疾病、肿瘤等疾病，如 HPV检测、HCV基因分型等
核酸扩增技术
目录
CONTENTS
• 核酸扩增技术概述 • 常用核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的应用 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术实验操作流程
01 核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种通过特定的生物 化学反应，将目标核酸片段在体外进 行快速、特异的复制的技术。
原理
基于DNA或RNA的复制机制，通过使 用引物和特定的酶，将目标核酸片段 进行指数级扩增，从而实现核酸的快 速扩增。
临床意义评估
结合临床样本情况和患者病情，对扩增结果进行解读 ，为临床诊断和治疗提供依据。
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THANKS
历史与发展
01
02
03
1980年代初期
最早的核酸扩增技术问世 ，基于PCR技术。
1990年代
随着技术的不断改进，出 现了多种核酸扩增技术， 如LAMP、TMA等。
21世纪
随着测序技术的发展，新 一代核酸扩增技术如数字 PCR、单分子测序等逐渐 兴起。
技术分类
基于PCR的方法
包括常规PCR、实时荧光定量PCR、数字 PCR等。
可定量
通过扩增过程中的荧光标记或电泳技术，可以确定核酸的相对或绝对 含量，有助于了解病情严重程度和治疗效果。
应用广泛
核酸扩增技术可以应用于各种不同的生物和医学领域，如病毒检测、 细菌鉴定、基因表达分析等。
缺点
易污染
扩增过程中可能出现假阳性结果，主 要原因是扩增产物污染或交叉污染。
高成本
核酸扩增技术需要昂贵的仪器、试剂 和探针，导致检测成本较高。
要点二
肿瘤诊断
通过扩增肿瘤相关基因的表达产物，可以辅助肿瘤的诊断 和预后评估，为肿瘤个体化治疗提供依据。
核酸扩增技术
pcr扩增技术原理
pcr扩增技术原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。
使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。
PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。
到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。
这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。
PCR原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种的作用下可以变性解链成单链，在DNA 聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子拷贝。
在体外实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链-退火-合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。
而发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
11核酸的体外扩增
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
PCR反应五要素
• 引物（primer） • 酶 （Taq DNA polymerase） • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,d3; （magnesium）
引物
• 引物是PCR特异性反应的关键
• PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 • 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做 引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大 量扩增
PCR反应条件的选择
• PCR反应条件:
– 温度 – 时间 – 循环次数
温度与时间的设置：
• 设置变性-退火-延伸三个温度点 • 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在 90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸 • 对于较短靶基因（长度为100～300bp时） 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火 与延伸
核酸体外扩增技术
核酸体外扩增技术陈庆山* 刘春燕 刘迎雪 刘海燕 陈立君 付 尧 单继勋 郭 强 张丽娜(东北农业大学大豆研究所 哈尔滨 150030)摘要 核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。
随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。
根据其特点可分为两类:一类是靶核酸的直接扩增,如聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应、核酸依赖的扩增、Q 复制、转录介导的扩增和滚环扩增等;另一类是信号放大扩增,如支链DNA、侵染探针等。
就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。
关键词 核酸体外扩增 靶核酸直接扩增 信号放大扩增核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。
随着生物技术的发展,建立一套灵敏、快速的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。
在聚合酶链式反应(PCR)以其灵敏性、特异性和快速性而广泛应用的基础上,新的核酸扩增模式也不断涌现。
现有核酸扩增技术根据其特点可分为两类:第一类是靶核酸的直接扩增;包括聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和核酸依赖的扩增(NASB A)、Q 复制、转录介导的扩增(TMA)和滚环扩增(RC A)。
另一类是信号放大扩增;包括支链DNA(bDNA)、侵染探针(Invader)和滚环扩增(RCA)等[1]。
其中滚环扩增是一种既能直接扩增靶核酸,又能实现信号放大扩增的方法。
根据是否需要温度循环也可分为两类:一类是非等温扩增体系,如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)等。
另一类是等温扩增体系,如链替代扩增(SDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、支链DNA(bDNA)、滚环扩增(RCA)、Q 复制酶系统。
本文根据扩增特点将各种核酸扩增技术进行总结,见表1。
收稿日期:2004 01 12 修回日期:2004 03 01 *电子信箱:qs hchen@s 表1 核酸扩增技术的特点核酸扩增分类特点DNA扩增RNA扩增D NA信号放大R NA信号放大蛋白质信号放大体内扩增微阵列上扩增非等温PCR++---+-扩增LCR+------靶核酸SD A++----+直接NASBA++-----扩增等温扩增TMA++-----Q 复制-+-----R CA+++++++信号放大扩增bDNA--++---等温扩增Invader--++---R CA+++++++1 靶核酸直接扩增1 1 聚合酶链式反应(PC R)自1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应,使体外无限扩增核酸片段得以实现[2]。
2010核酸体外扩增
一、变性温度及时间
94℃ 30秒可使各种复杂的DNA分子 完全变性。过高温度或高温持续时 间过长，可对Taq DNA聚合酶活性 和dNTPs分子造成损害。
二、退火温度及时间
1~100ng染色体DNA，一般在55℃左右， 模板量低，退火温度也相应降低，可减 少非特异扩增。 在45 ℃ ~65 ℃时延长退火时间对产量增 加影响不大，甚至会增加非特异条带。
三、dNTPs浓度
dNTPs保存在pH7.8~8.0溶液中。酸性环境 会使dNTP分解成dNDP、dNMP 4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制， 以减少错配误差和提高使用效率。 在PCR反应中，dNTPs浓度应在20~200 M， 浓度过高会抑制PCR反应，同时还可增加 碱基的错误掺入率。
低浓度的dNTP会导致反应速度的下降， 但能减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸 错误掺入，可提高实验的精确性。 决定最低dNTP浓度是靶序列的长度和组 成。（100l 20 M dNTP s 可以合成 2.6 g DNA或10pmol 400bp的序列。） 的序列。） 或 的序列 dNTP与MgCl2的浓度之间的关系成正相 关
原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利 用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进 行PCR扩增， RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级， 因此让一些极微量RNA样品分析成为可能。 作用：分析基因的转录产物、获取目的基因、 合成cDNA探针等。
引物长度一般为15~30bp，扩增片段长 度为100-600碱基对。引物过短会使特 异性降低，过长成本增加。 嘌呤与嘧啶的比例约1：1（引物序列中 G+C含量一般为40%-60%）。引物碱基尽 可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆 积现象，尤其是在3’端不应有连续3个G 和C.
分子生物学 第四章 核酸的体外扩增
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ataagcccgaaaggttcgtt 3′TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5′
变性（950C，30s）
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3′ ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 5′
ataagcccgaaaggttcgtt 退火（450C～550C，30s ～ 1min）
2、酶切分析
3、分子杂交 4、核酸序列分析
1 2 345
4：PCR扩增结果
六、PCR实验中常见问题对策
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是，不该出结果而出了结果 我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（一）假阴性：
应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性。最常见的原因：
延伸（720C，1 ～ 几分钟）
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核酸检测扩增分析方案
核酸检测扩增分析方案核酸检测扩增分析方案是通过核酸扩增技术对样本中的目标核酸进行快速扩增，并通过分析扩增产物的长度和数量来判断样本中是否存在目标核酸。
一、实验步骤：1. 样本处理：将待检测样本进行必要的前处理，包括DNA或RNA的提取和纯化。
可以采用商业化的DNA/RNA提取试剂盒进行提取和纯化操作。
2. 反转录（如果需要）：如果待检测的是RNA基因或病毒，需要进行反转录反应将RNA转录成cDNA。
反转录反应一般需要引入逆转录酶和随机引物。
3. 扩增反应体系的制备：根据待检测RNA或DNA的特点选择合适的扩增反应体系。
一般包括引物、核酸模板、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等。
4. 扩增反应的设计：根据目标核酸序列，设计合适的引物，确定扩增反应的温度和时间参数。
5. 扩增反应的设置：将反应体系按照设计好的条件设置在PCR仪或者其他扩增设备中进行扩增反应。
6. 扩增产物的分析：通过电泳分析扩增产物的长度和数量。
可以选择琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳进行分析。
7. 分析结果的解读：根据扩增产物的长度和数量来判断样本中是否存在目标核酸。
一般通过比较扩增产物的大小和预期大小来判断。
二、实验注意事项：1. 严格控制实验环境的无菌操作，避免引入外源性DNA污染。
2. 使用RNase或DNase等酶在提取和纯化过程中去除外源性RNA或DNA。
3. 设计引物时要注意避免引物间的互补和二聚体的形成，以确保扩增的特异性和效果。
4. 扩增反应过程中，注意控制反应体系的温度和时间，避免出现非特异性扩增或扩增结果的偏差。
5. 选择合适的电泳条件和电泳仪器，确保能够分辨目标核酸扩增产物的大小和数量。
6. 扩增反应的结果需要与正负对照进行比较，判断是否存在目标核酸。
三、实验优点和应用：1. 核酸检测扩增分析方案具有操作简单、灵敏度高、结果可靠等优点。
2. 可以应用于基因组DNA的检测、病原微生物的检测、基因表达的研究等领域。
3. 可以用于临床医学、食品安全、环境监测等领域的核酸检测。
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核酸体外扩增技术研究进展
摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。
核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。
随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。
就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。
关键词核酸体外扩增聚合酶链式反应（PCR）等温扩增
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。
核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。
核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。
而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。
一、聚合酶链式反应(PCR)
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。
聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。
近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。
已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。
前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。
信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)
和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。
而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。
二、核酸等温扩增技术
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。
近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。
在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中[3]。
1、链替代扩增技术
链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3’延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。
被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。
该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。
SDA的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。
整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。
2、滚环扩增技术
滚环核酸扩增（rolling circleamolification，RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。
线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。
指数RCA原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间
内，产物呈指数递增。
3、依赖解旋酶DNA扩增
依赖解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。
该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。
4、依赖核酸序列扩增
依赖核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程[4]。
5、环介导等温扩增
环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成[5-6]。
6、单引物等温扩增技术
单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由由3’端DNA部分和5’端RNA部分组成。
切割酶作用后暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。
7、快速等温检测放大技术
快速等温检测放大技术最早由中科院研究人员于2005年发明。
技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识别位点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针与目标基因序列杂交后形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在检测探针链切割，形成两小片段，小片段从目标序列脱落，另一DNA探针再与目标序列结合产生小片段，如此循环可得。
8、Qβ复制技术
Kacian等于1972年首次报道了Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板自我复制的功能。
Qβ复制酶是Qβ噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA聚合酶，以单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA，也可以指数式扩增重组DNA分子。
三、展望
核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段。
随着科学的发展和研究目的不同，出现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。
目前，基于PCR技术的检测方法是转基因检测的常规方法。
尽管传统PCR有着各种各样的优点，但在应用方面，还有其自身的缺点。
例如，循环中需要高精度的温度循环，扩增抑制剂对灵敏度的影响等，这些在转基因检测的应用中都是至关重要的。
等温扩增技术不需要高精度的热循环仪，非常适应于现场检测。
其他可选择的核酸扩增方法在某些方面也弥补了传统PCR技术的不足。
参考文献
[1] 陈庆山，刘春燕，刘迎雪，等．核酸体外扩增技术[J]．中国生物工程杂志，2004，24(5)：10~13
[2] 吕蓓，程海荣，严庆丰，等．体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新[J]．中国生物工程杂志，2011，31(3)：91~96
[3] 马丽敏，卢亦愚．核酸等温扩增技术研究进展[J]．浙江预防医学，2013，25(1)：24~27
[4]高闪电，常惠芸，丛国正，等．NASBA（依赖核酸序列的扩增）技术及其在病毒检测中的应用[J]．中国生物工程杂志，2009，29(1)：80~85
[5] 黄火清，郁昂．环介导等温扩增技术的研究进展[J]．生物技术，2012，22(3)：90~93
[6] 张建中，官小燕，张海波，等．可用于转基因产品检测中的核酸体外等温扩增技术分析[J]．中国农业科技导报，2010，12(4)：29~33。