核酸扩增及以PCR为基础的分子诊断技术
赛沛 genexpert 原理
赛沛 genexpert 原理以赛沛 Genexpert 是一种用于快速检测病原体的分子诊断技术。
它采用核酸扩增技术，能够在短时间内检测出病原体的存在，对于临床诊断和疾病控制具有重要意义。
Genexpert 技术原理是基于聚合酶链式反应（PCR）的扩增技术。
PCR 是一种体外快速扩增DNA的方法，将目标DNA片段经过多轮循环扩增后，可以得到数量可观的目标DNA。
Genexpert 利用PCR 技术扩增病原体的核酸，然后通过荧光探针实时检测扩增产物。
Genexpert 的扩增过程主要分为三个步骤：变性、引物结合和延伸。
首先，将样本中的病原体核酸变性，使其变为单链。
然后，引物与目标核酸的特异性序列结合，形成DNA-RNA 复合物。
最后，DNA 聚合酶以引物为模板，延伸目标核酸链，合成新的DNA 链。
这个过程将在循环中重复多次，每一轮都会使目标核酸的数量成倍增加。
Genexpert 的关键之处在于荧光探针的设计和检测系统的优化。
在扩增过程中，荧光探针会与目标DNA 片段结合，形成荧光信号。
这个信号会被检测系统实时监测，通过荧光信号的强度可以确定扩增产物的数量。
通过监测荧光信号的变化，可以确定样本中是否存在病原体。
Genexpert 技术的优点在于其快速、准确和高灵敏度。
相比传统的病原体检测方法，Genexpert 可以在短时间内完成检测，节省了时间和人力资源。
此外，Genexpert 还可以进行多种病原体的同时检测，提高了检测效率。
它的灵敏度高，能够检测到低浓度的病原体，有助于早期诊断和治疗。
Genexpert 技术在临床应用中有着广泛的用途。
它可以用于检测各种感染性疾病，如结核病、性病、呼吸道感染等。
此外，Genexpert 还可以用于判断病原体的耐药性，为临床治疗提供重要参考。
它还可以用于疫情监测和疾病防控，及时掌握病原体的传播情况，采取相应的措施。
总结起来，以赛沛Genexpert 是一种基于PCR 技术的分子诊断技术，能够快速、准确地检测病原体的存在。
分子诊断技术在生物学领域的应用分析
分子诊断技术在生物学领域的应用分析近年来，分子诊断技术在生物学领域得到了广泛的应用。
随着科学技术的发展和人类对疾病的深入研究，分子诊断技术能够对疾病的早期诊断、疾病发生的机制、药物疗效的监测等方面提供了很大的帮助。
本文将从分子诊断技术的基本理论和方法开始，阐述其在生物学领域的应用现状和前景。
一、分子诊断技术的基本理论和方法分子诊断技术是以人类DNA为核心研究对象的一种技术，它的基本理论是分子生物学，主要包括了基因测序、PCR扩增、细胞病理学等基本方法。
其中，PCR 扩增是分子诊断技术的核心技术之一，它能够在无需大量分离纯化DNA样本的情况下，通过引入特异性引物从而高度扩增目标DNA片段，进而利用不同实验室惯用的基因检测方法对PCR扩增产物进行检测和分析，以确定目标基因的存在性、基因型和表达水平等信息。
在基本技术的基础上，分子诊断技术又不断进行了创新和发展，出现了许多新的技术方法。
比如，下一代测序技术（NGS）通过同时对大量DNA分子进行测量、检测和序列化，使得大规模、靶点多样和全基因组分析变得可行，而且在研究基因细胞分型和定量分析方面表现出了应用优势。
同样，单粒子分析技术、分别测序和金属离子离子分析等技术方法也被广泛应用于分子诊断领域。
二、分子诊断技术在生物学领域的应用现状和前景分子诊断技术具有很广泛的应用前景，尤其在基因诊断、癌症诊断、高通量药物筛选和环境检测等领域。
下面我们就其应用案例和发展前景做一些简要的分析。
1. 基因诊断领域基因方式风险评估和基因诊断已成为临床分子诊断的核心之一。
基因诊断能够发现个体或家族的基因变异，从而帮助医生制定更为精细的治疗方案。
比如，靶向基因突变的肿瘤治疗方法与越来越重视的家庭基因风险评估等。
以Cystic Fibrosis （囊性纤维化）基因诊断为例，近年来关于该疾病的遗传学研究不断深入，分子筛查技术的开发和普及已经极大地促进了CF基因分型的明确和卡介绍预防的实施。
遗传性疾病分子诊断技术的研究
遗传性疾病分子诊断技术的研究遗传性疾病是由遗传因素引起的一类疾病，其中大部分疾病是由单个基因突变引起的，称为单基因遗传性疾病。
其余的疾病则称为多基因遗传性疾病。
在这些疾病中，基因的突变会导致蛋白质的功能异常或缺失，从而引起相关的疾病，如肌萎缩侧索硬化症，囊性纤维化等。
可以通过遗传检测技术，早期诊断这些疾病。
分子遗传学是研究个体遗传物质的结构、功能、变异和遗传性疾病发病机制的学科。
在分子遗传学中，分子诊断技术是一项关键的技术，包括PCR、Sanger测序、检测突变基因和类似的技术。
PCR技术是常用的核酸扩增技术之一。
它是以DNA聚合酶为媒介，通过引物二倍体沿模板DNA进行扩增，最终得到目的片段。
这种技术使用广泛，可以用于检测基因型和突变，如囊性纤维病突变检测。
Sanger测序是测定DNA序列的金标准技术。
这种技术的原理是，将DNA片段代入测序装置中的扩增过程中，通过加入不同特定的荧光含量的dNTPs（脱氧核苷三磷酸），以测序。
Sanger序列技术在研究遗传疾病的基因突变时也经常使用。
检测突变基因是单基因遗传病诊断的核心问题。
对于一些常见的单基因遗传病，部分疾病的基因定位和突变规律已被明确。
胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）等基因是有关巨细胞增生症（Gigantism）的遗传突变基因，其突变可以导致疾病发生。
研究发现，通过删除IGF-1R基因可以预防Gigantism的发生。
这种技术为控制疾病发生提供了一种新方法。
除此之外，还有其他分子遗传学技术广泛应用于遗传性疾病的诊断和预测，诸如荧光原位杂交、单细胞测序、功能分析和转录组分析等。
通过这些技术，不仅可以预测单个疾病发病的可能性，还可以填补遗传和保健之间的空白。
虽然分子遗传学技术已经具备了足够的实用性和安全性，但是在使用过程中仍然会存在一些问题和挑战，比如样本提取的困难、误差率高等问题。
这也需要逐步解决。
综上，分子遗传学技术在遗传性疾病的早期诊断、疾病治疗和疾病预防方面发挥着越来越重要的作用。
分子诊断学之核酸扩增技术-荧光定量PCR技术
荧光实时定量PCR技术是1992年Higuchi第 一次报告提出的，当时的标记染料就是EB，检 测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控 PCR反应的进程。
PCR反应的数学函数关系，结合相应的算 法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样 品中的目标基因进行准确定量。
4
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，该技术实现 了PCR从定性到定量的飞跃，克服了常规PCR 技术的诸多问题，为PCR技术进入临床应用打 开了成功之门。 与常规PCR相比，它具有特异 性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度 高等特点，目前已被广泛应用。
不能做多重检测：每孔只能检测一个目标基因 灵敏度低：适合于5000 拷贝以上的基因定量
27
2. 荧光标记探针法
5' 3'
R
Q
5'
3'
3'
5'
14
什么是CT值
荧光信号有统计学意义显著增长（即穿过阈值 线）时的循环次数
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
半对数图谱
CT值
CT值
15
什么是阈值（threshold）
• PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本
底信号
• 荧光阈值是3-15个循 环的荧光信号的标准 偏差的10倍，即： threshold = 10 ´ SDcycle 3-15
N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E： 扩增效率 n: 循环数
9
PCR方程只在指数期成立
线性增长期
平台期
Log [DNA]
指数增长期 y = x(1+e)n
病原分子诊断方法有哪些
病原分子诊断方法有哪些与传统的细菌培养等检测手段相比，分子诊断技术具有特异、敏感、快速及便捷等优势，必将在病原学诊断方面发挥越来越重要的作用。
尽管目前这些技术尚存在假阳性、假阴性等不足，且操作复杂，成本昂贵，甚至有些技术仍处于起步和基础研究阶段，临床尚有待推广。
但随着经济水平的提高和科技的不断发展，分子生物学技术在临床中的转化应用将逐渐成为临床病原学诊断的主要手段。
一、分子诊断的PCR技术传统的检测方法是基于培养方法对传染病病原体进行表型特性分析。
事实证明，分子诊断比传统的方法更快速、更灵敏。
在许多情况下，病原体不再需要数天或数周才能复制或繁殖，而相反，传染病病原体鉴别可以在几分钟至数小时即可完成。
针对于生物个体的遗传特征分析技术已成为可能。
在过去二十多年中，分子诊断历经彻底革新。
随着20世纪80年代聚合酶链反应（PCR）的发明，由于核酸体外复制变成可能，因此仅需患者的少量样品即可获得足够的遗传物质进行疾病检查。
PCR技术需要加热和冷却多个循环步骤。
最初，实验室人员需要手动将样品在热水浴和冷水浴之间转移，历时数小时，现在已经实现热循环自动化设备。
此外，Taq聚合酶的发现使PCR过程实现自动化及大规模使用。
分子诊断的第一步是从患者标本中提取核酸。
现在我们可以使用相对简单和低成本的方法实现核酸提取。
但是，这个步骤确实需要耗费时间，并且需要手工操作来装载和拆卸仪器部件。
新的核酸提取方法是采用自动化提取，不需要额外的设备或手动步骤。
提取过程主要两个阶段是生物体裂解和核酸纯化。
裂解阶段可以通过压力，热量，化学物质，超声处理或机械方法；纯化阶段可以通过将核酸固定在结合材料上，经洗涤数次后，再将核酸洗脱到水或缓冲液中。
PCR扩增结束后需要提供一种方法来检查是否获得PCR产物或称为扩增子，如果获得，那么有多少扩增子。
过去几年来，凝胶电泳分析是检测PCR产物的主要方法，但非常费力耗时且具有潜在危险。
实时荧光PCR技术在扩增过程中实现定量检测扩增子，例如使用荧光染料，DNA浓度及荧光强度均可以实时检测。
filmarray检测原理
filmarray检测原理一、引言FilmArray是一种快速、可靠、高通量的分子诊断技术，可以在一个小时内检测出多种病原体。
它通过PCR扩增和电泳分离的方式对样本中的核酸进行检测。
本文将详细介绍FilmArray检测原理。
二、样品处理首先，需要对样品进行处理，以便于电泳分离和PCR扩增。
FilmArray使用的是裂解剂和磁珠技术来提取样品中的核酸。
首先，样品加入到试管中，并加入裂解剂，使细胞壁破裂并释放核酸。
然后，加入磁珠来吸附核酸，并将其从其他杂质中分离出来。
最后，用洗涤液洗去杂质，并用缓冲液溶解核酸。
三、PCR扩增接下来，对样品中的核酸进行PCR扩增。
FilmArray使用了一种多重PCR技术，可以同时扩增多个基因片段。
这种技术被称为Nested PCR（嵌套式PCR）。
Nested PCR包括两轮PCR反应：第一轮PCR 反应扩增目标DNA片段；第二轮PCR反应在第一轮反应产物基础上扩增内部片段。
Nested PCR可以提高PCR反应的特异性和敏感性。
四、电泳分离PCR扩增后，需要将产物进行电泳分离。
FilmArray使用微流控芯片来进行电泳分离。
微流控芯片是一种微型实验室，可以在非常小的空间内完成多个反应步骤。
在FilmArray中，每个微流控芯片包含多个小孔，每个小孔都包含一种检测目标（例如细菌、病毒等）的PCR产物。
这些PCR产物被注入到小孔中，并与荧光探针结合。
然后，将荧光探针注入到小孔中，并使用激光器对其进行激发。
如果PCR产物与荧光探针结合，则会发出荧光信号。
该信号被检测器检测并记录。
五、数据分析最后，需要对收集到的数据进行分析和解读。
FilmArray使用了一种名为“查找表”的算法来解读数据。
查找表是一个预先定义好的数据库，其中包含了各种病原体的DNA序列信息以及相应的荧光信号阈值范围。
当收集到荧光信号时，算法会将其与查找表中的信息进行比对，并确定检测到的病原体种类和数量。
分子诊断发展简史
分子诊断发展简史：一场由“螺旋双杰”引发的发明分子诊断发展四阶段第一阶段：利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断：通过婴儿胚胎期进行产前诊断，超早期预知某些疾病发生、发展和预后。
1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA 分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。
第二阶段：以PCR为基础的分子诊断：PMullis发明PCR技术后迅速发展，标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。
第三阶段：以生物芯片技术为代表的高通量检测技术：1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。
生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。
第四阶段：以NIPT为代表的第二代测序技术：Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均为通过DNA 片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。
1代、2代测序区别分子诊断三座丰碑1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。
在以后的近50年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。
DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志，对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义，为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。
“DNA之父”Wa tson、Crick50年前，科学界的“八大恶棍”之一凯利•穆利斯还只是美国某制药公司的小职员，整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦，然而先要复制DNA，才有足够的时间慢慢修复。
分子诊断技术在临床诊断中的应用
分子诊断技术在临床诊断中的应用医学领域中，分子诊断技术一直是一个备受关注的领域。
作为一种基于 DNA 或 RNA 信号的技术，它可以精确地确定存在于生物体中的某些特定基因或其他分子物质。
在近年来，随着技术的不断发展，分子诊断技术在临床诊断中的应用逐渐得到了广泛的应用。
本文将从分子诊断技术的定义、原理、以及在临床诊断中的应用等方面进行探讨。
一、分子诊断技术的定义和原理分子诊断是一种利用分子生物学技术检测人体上的细胞和分子物质的技术。
其主要依据是基于细胞和分子物质的基本生物学特征，使用多种分子检测技术，通过检测样本中存在的不同分子量的DNA或RNA的浓度，来对某种疾病进行检测。
这种技术可以有效地检测整体样本、单个生物分子如基因和蛋白质等，以确定包含 DNA 或 RNA 的生物分子的特定性。
在分子诊断检测中，PCR 和序列测定是最常用的工具。
PCR 可以扩增 DNA 序列，而序列测定则可以测定 DNA 序列。
PCR 可以通过反复复制特定的 DNA 部分，从而放大寻找重要 DNA 片段的帮助。
PCR 技术扩增出来的 DNA 片段则可以通过 DNA 各种方法进行检测，如测序、碱基链聚合酶（Taqman）测序，ROCHE，Bayers，Singulex 等技术，同时，这些技术有助于检测某些病原体存在的DNA或RNA分子。
二、分子诊断技术在临床诊断中的应用1、肿瘤诊断分子诊断技术在肿瘤诊断中的应用得到了广泛的应用。
该技术可以通过检测人体细胞中存在的肿瘤特异性标志物，快速进行肿瘤诊断。
目前，临床肿瘤检测的主要方法是检查肿瘤相关分子或细胞，如胶质瘤标志物 GFAP 等。
分子诊断检测技术可以快速准确地检测出患者肿瘤细胞中的分子物质生成的情况，特别是纳米颗粒检测技术可精确鉴定并定量肿瘤标志物，从而对肿瘤进行早期发现和诊断。
2、遗传性疾病检测分子诊断技术在遗传性疾病检测中也起到了重要的作用。
该技术通过精确的基因检测和突变判定，可以确定某些疾病是否具有遗传性。
核酸扩增技术
• 核酸扩增技术概述 • 主要核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术的实验操作流程 • 核酸扩增技术的应用案例
01
核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种分子生物学 技术，通过特定的酶促反应，将 核酸片段在体外进行指数级扩增 ，以便进行后续的检测和分析。
原理
潜在的交叉污染风险
在实验过程中，如果操作不慎或仪器清洁不到位，可能导致交叉污染， 影响实验结果。
成本较高
虽然核酸扩增技术所需仪器设备和试剂已经逐渐标准化，但仍相对较 高，对于一些资源有限的地区和实验室来说可能存在经济压力。
04
核酸扩增技术的实验操作流程
样本处理
01
02
03
样本收集
采集具有代表性的样本， 确保样本质量。
qPCR技术
总结词
实时荧光定量聚合酶链式反应是一种在PCR反应过程中加入荧光标记，通过荧光信号的 积累实时监测PCR进程的技术。
详细描述
qPCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时 监测PCR进程，最后通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。该技术具有高灵敏度、 高特异性和可定量等优点，广泛应用于基因表达分析、突变检测和病毒载量测定等领域。
2000年代以后
随着测序技术的发展，新一代核酸 扩增技术如高通量测序、数字PCR 等逐渐崭露头角，广泛应用于生命 科学、医学等领域。
应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于基因克隆、基因组测序、 基因表达分析等基础研究领域
。
临床诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 感染性疾病、肿瘤等疾病，如 HPV检测、HCV基因分型等
分子诊断技术的临床应用
。尿道分泌物：同上
项目
标本采集
HBV 无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入 HCV 无菌试管或抗凝管。
EB 1.鼻咽拭子或体液标本。 2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
CMV 1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。 其他体液标本或咽拭子。 也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
TB 1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试 管。 2.其他组织标本：留于无菌试管。 3.也可取抗凝血标本,但需分离单个核细胞检 测，阳性率才会高。（于发热时抽取）
SAT 检测技术的优势：
检测靶标：RNA 灵敏度高，特异性强，易鉴别死 菌、活菌，适合临床判愈;
扩增产物：RNA 高效扩增，低污染; 核酸提取：磁珠法 提取纯度高 结果准确; 检测方法：实时荧光检测，扩增、检测同时进行
全程监控; 扩增方式：42℃恒温 无需热循环，设备成本低。
总结
分子诊断技术经历近30年的快速发展，已经形成了主要以杂交、测序和
病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检
测 优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱
疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB） 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、
伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等
《Science》杂志上发表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq
DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 10月13日 Mullis获诺贝尔化学奖 1995 荧光定量PCR技术出现
九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用 于临床检测
传染病的分子诊断方法与技术
传染病的分子诊断方法与技术传染病一直是人类面临的重要公共卫生问题之一。
为了更好地预防和控制传染病的传播，科学家们致力于发展和改进分子诊断方法和技术。
本文将介绍目前常用的几种分子诊断方法，并探讨它们在传染病防控中的应用。
一、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种常见的分子诊断方法，通过扩增DNA片段的方法可以快速检测出传染病病原体的存在。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶在加热和退火的循环条件下，将DNA的目标序列扩增到大量可检测的水平。
这使得PCR技术非常灵敏，可以在短时间内准确检测出病原体的存在。
在传染病的分子诊断中，PCR技术被广泛应用于疾病的早期检测和鉴定。
例如，对于新型冠状病毒肺炎（COVID-19），PCR技术被用于检测患者体内是否存在病毒的遗传物质RNA。
这种基于PCR的病毒核酸检测方法成为目前最主要的COVID-19诊断方法之一。
二、核酸序列分析核酸序列分析是通过对病原体的核酸进行检测和分析，以确定其种类和特征。
核酸序列分析包括序列比对、序列测定和序列分型等步骤。
这些步骤可以通过技术手段进行自动化，提高分析效率和准确性。
核酸序列分析在传染病的分子诊断中发挥着重要作用。
例如，在疟疾的诊断中，通过对疟原虫的核酸序列进行分析，可以确定疟疾的致病种类，并判断其耐药性和传播途径等信息。
这为疟疾的防控提供了重要的参考指标。
三、免疫技术免疫技术是一种通过检测和分析体内产生的免疫应答来诊断传染病的方法。
免疫技术主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法和流式细胞术等。
这些技术基于抗原与抗体的特异性结合，可以在短时间内准确检测出病原体或人体对病原体的免疫应答。
免疫技术在传染病的分子诊断中具有重要意义。
以HIV感染为例，通过检测体内产生的HIV特异性抗体，可以判断人体是否感染HIV病毒。
这种基于免疫技术的诊断方法成为HIV感染的常用筛查手段。
总结：传染病的分子诊断方法与技术为疾病的早期检测、鉴定和监测提供了重要的工具。
分子诊断技术在肿瘤诊治中的应用
分子诊断技术在肿瘤诊治中的应用肿瘤是人类健康问题的一大难题。
随着社会的发展，科技水平的提高，肿瘤的防治工作也在不断改进。
其中，分子诊断技术就是目前肿瘤防治技术中较为前沿的一种。
它以DNA和RNA为基础，借助核酸检测和基因芯片技术等手段，快速准确地诊断肿瘤和判断治疗效果。
下面就分子诊断技术在肿瘤诊治中的应用，从基础知识、检测方法和诊治效果三个方面进行探讨。
一、分子诊断技术的基础知识分子诊断技术是建立分子生物学、生物化学、遗传学以及免疫学等多学科知识和技术手段基础上实现的。
它的关键步骤是核酸和蛋白质检测，其中，核酸检测是核心环节。
核酸的检测可以分为两个步骤：萃取和扩增。
萃取是从人体的检测样本中提取出核酸，进而进行下一步扩增。
常用的核酸萃取方法有酚-氯仿法、盐酸法、离子交换法、硅胶纯化法等。
其中，硅胶纯化法更加快速、高效，已经成为了肿瘤检测的最佳选择。
扩增是指对已经提取出来的核酸进行扩增，以便寻找肿瘤相关的异常基因序列。
常用的DNA扩增方法有PCR技术、LAMP技术、qPCR技术等。
这些技术的原理是利用特殊引物将DNA进行复制，使得原有的DNA序列扩增成为更多的复制体，方便核酸检测。
二、分子诊断技术的检测方法分子诊断技术检测到的异常基因序列可以从遗传性和获得性两个方面进行分析。
其中，遗传性异常基因主要表现为遗传性肿瘤、家族性肿瘤等遗传性病症。
而获得性异常基因则是人体内各种因素引起的突变，如长期暴露在有害物质中、不良生活习惯、疾病感染等。
分子诊断技术所使用的方法有多种，包括核酸检测技术、蛋白质检测技术以及免疫学检测技术等。
其中，核酸检测技术是应用最广泛的技术之一，包括PCR技术、Sanger测序技术、末端限制酶切分析法等。
这些技术对癌症患者的检测效果都非常好，课准确、快速地为患者揭示疾病。
三、分子诊断技术在肿瘤诊治中的应用效果分子诊断技术的应用使得肿瘤的诊治工作更加高效和精准。
目前，这种技术在临床诊断、疾病预警和基因治疗等多个方面都有广泛的应用。
分子诊断学之核酸扩增技术-聚合酶链反应技术
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30Biblioteka 1,073,741,824
17
CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
一、 聚合酶链反应技术
polymerase chain reaction，PCR
（一）PCR技术发展简史 （二）PCR技术原理 （三）PCR反应体系、条件及其优化 （四）扩增产物检测及分析 （五）PCR常见问题与原因分析 （六）PCR衍生技术
1
概念
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR ） 是 指 在 DNA 聚 合 酶 催 化 下 ， 以 母 链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通 过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出 与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是DNA体外合成放大技术，能快速特异地 在体外扩增任何目的DNA。
2
（一）PCR技术发展简史
1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结 构及半保留复制模型。
1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。
70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
3
1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺 贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合 适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不 断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因：
核酸扩增的原理
核酸扩增的原理核酸扩增是一种重要的分子生物学技术，用于在体外复制DNA或RNA的方法。
它是通过扩增目标序列的DNA或RNA分子量来分析其结构和功能，也是生物学研究、遗传病诊断、DNA指纹鉴定等领域的基础技术。
核酸扩增的原理主要包括选择适当的扩增方法、设计引物、选择适当的酶和酶的特性、反应条件的优化等。
核酸扩增的方法有多种，其中最常用的是聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，它可以迅速复制少量DNA片段，从而在实验室中产生大量可用于分析的DNA。
PCR反应基于DNA的链式扩增原理，包括三个主要步骤：变性、引物结合和扩增。
变性是PCR反应的第一步，它是将DNA模板中的双链DNA分离为单链DNA 的过程。
这一步通过在高温下使DNA解离来实现。
当反应混合物中的DNA模板处于高温时，双链DNA的氢键会断裂，分离成两条单链DNA。
在扩增中，通常需要将反应混合物加热至94-98摄氏度。
引物结合是PCR反应的第二步，它是使引物与目标序列特异性结合的过程。
在这一步中，反应混合物降温，使引物与目标序列互补配对。
引物通常是由DNA 合成的寡核苷酸，具有与目标序列末端互补的核酸碱基序列。
一条引物是朝一个特定方向扩增目标序列的，而另一条引物是朝相反方向扩增目标序列的。
扩增是PCR反应的第三步，它是通过DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链的过程。
在这一步中，反应混合物升温至DNA聚合酶的最适温度（通常为55-72摄氏度），以使酶能够在引物的引导下合成新的DNA链。
DNA聚合酶首先会结合到引物的末端，然后向引物的反向方向移动，并合成与目标DNA 互补的新的DNA链。
这个过程会在每一轮循环中重复，每一轮都会产生新的DNA链。
PCR反应循环通常包括变性、引物结合和扩增三个步骤，并在一个反应体系中进行多次循环。
每一轮循环将产生两倍数量的目标DNA序列。
经过多轮循环后，PCR反应可以迅速产生高浓度的目标DNA序列。
智慧树答案临床分子生物学检验技术知到课后答案章节测试2022年
第一章1.下列哪项被称作分子生物学现代分子生物学诞生的里程碑（）。
答案:DNA双螺旋2.分子生物学已成为推动临床医学向着以（）等为特征的现代医学发展的重要推手。
答案:预防医学;预测医学;参与医学;个体化医学3.临床分子生物学检验技术的发展经历了哪四个阶段（）。
答案:以生物芯片（biochip）技术为代表的诊断方法 ;以PCR技术为基础的诊断方法 ;以核酸分子杂交技术为基础的诊断方法 ;以DAN测序技术和生物质谱技术为代表的诊断方法4.分子诊断可以判断基因样本是否发生变异，帮助确诊、规避某些疾病（）。
答案:对5.个体发育、组织分化以及癌症发生发展都与细胞内miRNA基因表达调控有关（）。
答案:对第二章1.2019nCOV病毒的核酸类型是（）。
答案:正链RNA2.关于病毒的基因组，下列错误的( )。
答案:病毒的基因组重复序列多3.重复序列可分为（）答案:中度重复序列 ;高度重复序列;轻度重复序列4.真核生物的遗传物质绝大部分存在于细胞核染色体，少部分存在于线粒体或叶绿体中（）。
答案:对5.生物体中所有的基因都能编码蛋白质或RNA( )。
答案:错第三章1.核酸的分离和纯化的第一步是（）。
答案:破坏细胞、释放核酸2.用于肺炎支原体DNA检测的痰液标本应悬浮于（）答案:生理盐水3.基因组DNA提取的方法有（）答案:硅胶柱模法 ;苯酚抽提法 ;缠绕法4.棉拭子采集手足口病患儿病原体肛拭子阳性率高于咽拭子（）。
答案:对5.核酸沉淀过程中，乙醇易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀，且难以挥发除去( )。
答案:错第四章1.PCR技术的本质是（）答案:核酸扩增技术2.PCR实际上是重复进行DNA复制的过程，具体步骤为（）答案:变性，退火，延伸3.实时荧光定量PCR的特点是（）答案:重复性好;特异性强 ;速度快;灵敏度高 ;定量准确4.PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值高5℃( )。
答案:错5.SNP是指不同个体DNA序列中基因组内多个核苷酸差别所引起的DNA序列多态性( )。
lamp技术介绍以及在微生物检测中的应用
研究生课程论文课程: 微生物检测技术题目LAMP技术及其在微生物检测中的应用姓名: 王飞学院: 生命科学学院专业: 微生物学号: 201121601620 11 年12 月30 日LAMP技术及其在微生物检测中的应用摘要：环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。
与传统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增，且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果。
因此LAMP是一种不需要热循环仪、肉眼即可判定结果的高度特异和敏感的DNA 扩增方法。
近年LAMP技术在病原微生物检测及食品微生物检测上已有广泛应用，本文就LAMP极其在这两方面的研究进展作一综述。
关键词：LAMP；环介导等温扩增；核酸扩增Application of LAMP in detection of microorganism Abstract:LAMP (loop-mediated isothermal amplification) method, which develops in recent years, is a sensitivity, special and convenience nucleic acid amplification technique. To compare with the traditional PCR, LAMP, which needn’t hot circle, is constant temperature amplification. Because LAMP can produce a mount of coproduce, magnesium pyrophosphate,which is a white precipitation,the result can be estimated by eyes or nephelometer without electrophoresis. In recent years, the application of LAMP in detection of disease pathogen and microorganism in food had been wide studied. These articles summarize the studies in these two aspects.Key words:LAMP; loop-mediated isothermal amplification; nucleic acid amplification 1.引言核酸体外扩增技术是分子生物学领域最重要的研究手段之一，以检测核酸为基础的分子诊断技术已广泛应用于临床医学和微生物检测等领域。
核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展
核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展近10余年来现代分子生物学的迅猛发展，为临床实验室诊断提供了较为可靠的核酸检测方法。
经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术已广泛应用于结核病的诊断；然而，由于污染问题严重，扩增抑制物的存在，试剂盒缺乏规范化、标准化，加之技术、条件、质控等方面因素影响，其敏感性、特异性差异颇大，人们对其可信度、可靠性产生了怀疑，给临床医生诊断结核病带来了一定的困惑。
为此，国外学者开发出具有高度敏感性、特异性、标准化、商品化的PCR扩增试剂盒；继PCR之后，又发展了几种新的核酸体外扩增技术。
现就其在结核病诊断方面的应用与进展作一介绍，供广大同道借鉴。
一、PCR为基础扩增反应即Roche Amplicor结核分支杆菌PCR试验(Amplicor pCR)Amplicor PCR系应用生物素标记位于结核分支杆菌16S rRNA基因中高度保守区域种特异性引物扩增结核分支杆菌复合群DNA 中584 bp序列；生物素标记的扩增子(amplicon)与种特异性DNA探针进行杂交后，应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定，结果判断以450 nm波长时吸光度(A450)＞为阳性标准［1～3］。
Amplicor pCR是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒，该试剂盒有三个不同的小盒：标本处理盒、扩增盒和鉴定盒。
为防止交叉污染，厂商推荐试剂制备、标本处理、扩增与鉴定应三室分开，此外，应用尿嘧啶-N-糖基化酶控制扩增子携带污染。
研究表明，Amplicor pCR可检出少至2～10个结核分支杆菌中DNA。
与培养法相比，Amplicor pCR检测临床标本中结核分支杆菌DNA的敏感性为%～%，特异性达%～%，阳性预计值(PPV)66%～93%，阴性预计值(NPV)98%～%［2～4，6］。
若参考临床综合诊断，其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为%～%、%～100%、%～100%、%～%，该方法至少与培养法一样敏感［1，4～6］。
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• TMA主要应用于HLA 基因分型、细菌与病毒的快速检测。
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2.2 转录介导的扩增方法
第一阶段 扩增
Step1. Mix all ingredients.
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2.2 转录介导的扩增方法
Step2. The Primer#1 binds, and RT binds to 3'end of primer.
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2.2 转录介导的扩增方法
Step5. RNA polymerase binds to the promoter sequence of the dsDNA.
第二阶段 检测
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
单击此处编辑母版标题样式
核酸扩增及以PCR为基础的分 子诊断技术
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、以PCR为基础的分子诊断技术
四、小结
单击此处编辑母版标题样式 一、核酸扩增技术背景
核酸扩增技术
基因信息可视化
单击此处编辑母版标题样式 一、核酸扩增技术背景 -cont.
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式
2.2 转录介导的扩增方法
• 2002，rry Mimms发明TMA。 • TMA体系中含两种酶:
– Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶 – T7 RNA聚合酶 – 2种酶共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统。
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
单击此处编辑母版标题样式 2.3 连接酶链式反应(LCR)
• (Ligase chain reaction，LCR)
• 即在D N A 连接酶的作用下，通过连接与模板D N A互补的两个相邻寡核苷酸链探针，使匹配探针快 速扩增。
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA) – 探针扩增 • 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.5 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
扩增的目的序列？
循环
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA) – 探针扩增 • 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
引物
DNMT3a X1
单击此处编辑母版标题样式
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
94 C (30 s) 40-60 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb)
Melt
Anneal
Extend
20-30X
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
单击此处编辑母版标题样式 2.3 连接酶链式反应(LCR)
Gap
荧光信号产生物质
生物素
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
• SDA:链替代扩增反应作为一种体外恒温酶控扩增体系， 主要基于限制酶打开缺口和无外切酶活性的聚合酶的聚合 替代的原理;dATPaS代替dATP,在PCR反应中产生修饰的 产物，其丧失HindII酶切位点。 • HindII:切割第一阶段产生的替换链，产生第二阶段延伸需 要的引物，并生成最后的目的片段；
反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体） 、 延长、终止（三阶段） 模板DNA （基因组DNA） 产物： 拷贝数增加一倍
单击此处编辑母版标题样式
DNA合成
DNA聚合酶 的功能
DNA复制中的 错配修复
DNA水解
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
5' G T T G A C 3' P3'C A A C T G 5' 5' G T T 3' P3'C A A C T G 5'
• exo Klenow DNA聚合酶:没有外切酶活性，作用是合成修 饰的替换链；
• 主要用于细菌的检测、核酸定量、建立体外进化模型。
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
40-60 C (30 s) 94 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb)
Melt
Anneal
Extend
20-30X
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式
2.1 聚合酶链反应
Kary Mullis
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
类似DNA复制的体外DNA扩增技术
DNA的体内复制：
单击此处编辑母版标题样式 PCR：
template DNA（genomic DNA ， cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs
原理：利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理，在 分子水平上检测高危型HPV病毒、HBV、CMV。
单击此处编辑母版标题样式 2.5 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、小结
单击此处编辑母版标题样式
BRAF V600E
甲状腺癌的分子诊断
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、小结
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
• 引物
• 引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复 制的起始点，在核酸合成反应时，提供自由的3′-OH。
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
磷酸二酯键
原料：template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs
酶： 解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶
DNA polymerase
反应条件： 胞液环境，37 ℃
buffer，三种变化的温度（94，50-70 ，72 ℃），cycles（25-35） denaturation、annealing 、 extension （三阶段，多循环） 目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍
Step3. RT synthesizes first strand of cDNA (left) and degrades RNA template (right).
Step4. Primer #2 binds to the cDNA, and RT begins synthesis for the second strand of cDNA.
单击此处编辑母版标题样式 2.4 支链DNA( bDNA)扩增
bDNA扩增是Chiron推出的一种不依赖PCR扩增的核酸杂 交信号放大检测技术。 主要应用在CMV、HBV、HCV和HIV等病毒定量检测、基 因表达分析等方面。
单击此处编辑母版标题样式 2.4 支链DNA( bDNA)扩增
碱性磷酸酶