核酸扩增及以PCR为基础的分子诊断技术

• TMA主要应用于HLA 基因分型、细菌与病毒的快速检测。
单击此处编辑母版标题样式
2.2 转录介导的扩增方法
第一阶段 扩增
Step1. Mix all ingredients.
单击此处编辑母版标题样式
2.2 转录介导的扩增方法
Step2. The Primer#1 binds, and RT binds to 3'end of primer.
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.3 连接酶链式反应(LCR)
• (Ligase chain reaction，LCR)
• 即在D N A 连接酶的作用下，通过连接与模板D N A互补的两个相邻寡核苷酸链探针，使匹配探针快 速扩增。
单击此处编辑母版标题样式 2.3 连接酶链式反应(LCR)
Gap
荧光信号产生物质
生物素
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
• SDA:链替代扩增反应作为一种体外恒温酶控扩增体系， 主要基于限制酶打开缺口和无外切酶活性的聚合酶的聚合 替代的原理;dATPaS代替dATP,在PCR反应中产生修饰的 产物，其丧失HindII酶切位点。 • HindII:切割第一阶段产生的替换链，产生第二阶段延伸需 要的引物，并生成最后的目的片段；
反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体） 、 延长、终止（三阶段） 模板DNA （基因组DNA） 产物： 拷贝数增加一倍
单击此处编辑母版标题样式
DNA合成
DNA聚合酶 的功能
DNA复制中的 错配修复
DNA水解
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
单击此处编辑母版标题样式
核酸扩增及以PCR为基础的分 子诊断技术
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、以PCR为基础的分子诊断技术
四、小结
单击此处编辑母版标题样式 一、核酸扩增技术背景
核酸扩增技术
基因信息可视化
单击此处编辑母版标题样式 一、核酸扩增技术背景 -cont.
Step3. RT synthesizes first strand of cDNA (left) and degrades RNA template (right).
Step4. Primer #2 binds to the cDNA, and RT begins synthesis for the second strand of cDNA.
原理：利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理，在 分子水平上检测高危型HPV病毒、HBV、CMV。
单击此处编辑母版标题样式 2.5 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、小结
单击此处编辑母版标题样式
BRAF V600E
甲状腺癌的分子诊断
单击此处编辑母版标题样式 大纲
一、核酸扩增技术背景
二、核酸扩增技术
三、小结
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
40-60 C (30 s) 94 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb)
Melt
Anneal
Extend
20-30X
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
原料：template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs
酶： 解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶
DNA polymerase
反应条件： 胞液环境，37 ℃
buffer，三种变化的温度（94，50-70 ，72 ℃），cycles（25-35） denaturation、annealing 、 extension （三阶段，多循环） 目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式
2.1 聚合酶链反应
Kary Mullis
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
类似DNA复制的体外DNA扩增技术
DNA的体内复制：
单击此处编辑母版标题样式 PCR：
template DNA（genomic DNA ， cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs
– 探针扩增
• 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式
2.2 转录介导的扩增方法
• 2002，Dr.Larry Mimms发明TMA。 • TMA体系中含两种酶:
– Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶 – T7 RNA聚合酶 – 2种酶共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统。
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
扩增的目的序列？
循环
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA) – 探针扩增 • 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支Hale Waihona Puke BaiduDNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
引物
DNMT3a X1
单击此处编辑母版标题样式
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
94 C (30 s) 40-60 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb)
Melt
Anneal
Extend
20-30X
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
• 引物
• 引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复 制的起始点，在核酸合成反应时，提供自由的3′-OH。
单击此处编辑母版标题样式 2.1 聚合酶链反应
磷酸二酯键
5' G T T G A C 3' P3'C A A C T G 5' 5' G T T 3' P3'C A A C T G 5'
• exo Klenow DNA聚合酶:没有外切酶活性，作用是合成修 饰的替换链；
• 主要用于细菌的检测、核酸定量、建立体外进化模型。
单击此处编辑母版标题样式 2.4 链替换扩增(SDA)
单击此处编辑母版标题样式
2.2 转录介导的扩增方法
Step5. RNA polymerase binds to the promoter sequence of the dsDNA.
第二阶段 检测
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA)
单击此处编辑母版标题样式 二、核酸扩增技术
分类 – 目的序列扩增
• 聚合酶链反应(PCR) • 转录介导的扩增( TMA) – 探针扩增 • 连接酶链式反应(LCR) • 链替换扩增(SDA)
– 信号扩增
• 支链DNA( bDNA)扩增 • 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.5 杂交捕获分析
单击此处编辑母版标题样式 2.4 支链DNA( bDNA)扩增
bDNA扩增是Chiron推出的一种不依赖PCR扩增的核酸杂 交信号放大检测技术。 主要应用在CMV、HBV、HCV和HIV等病毒定量检测、基 因表达分析等方面。
单击此处编辑母版标题样式 2.4 支链DNA( bDNA)扩增
碱性磷酸酶