体外基因扩增

序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
• 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源
链
DNA加倍
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
Байду номын сангаас
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
温 94
度
72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
单性
子链延伸
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件 • 第PC3R轮过程扩增 • PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
酶 100 活 80 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
引物
合成引物
引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
• 1985 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 （ ABI 前 身 ） 的 Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶
不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
生物样品
……
DNA片段
基
基
基
法人
因
因
因
医类
诊
治
工
学学
断
疗
程
检研
产
测究
品
基因组DNA
扩
获取特定DNA片段
增
特
定
片 段
DNA
DNA聚合酶
引物 引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
体外基因扩增
——PCR技术
Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
链
DNA加倍
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
• PCR的特点
Taq酶 引物1
各200umol/L 各10～100pmol
0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
12
3
高温变性 低温退火 适温延伸
温 94
度
72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
单性
子链延伸