病毒核酸的提取、扩增

注意事项
尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；
减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；
减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高 温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长 的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻 贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对 象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的 环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。高温如长时间煮沸， 除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏 作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与 低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。
特异性强 敏感度高 快速 简便 对原始材料质量要求低 具有一定程度单核苷酸错误掺入
可能原因
解决方案
病毒核酸提取的主要步骤
破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质等生物大分子 去除其它不需要的核酸分子 沉淀核酸 去除盐类，有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸定量及保存
原理
• 病毒核酸包括DNA、RNA两种分子 •无论是游离病毒细胞中都是以与蛋白质结合(离子键、氢键、范德 华力)的状态存在 •破坏二者结合的试剂：
防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二 酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2 、 Ca2 的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶 活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、 不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。
去污剂：SDS；蛋白变性剂：盐酸胍、异硫氰酸胍；蛋白酶：K、E
•去除蛋白(有机溶剂酚和氯仿)，离心后，上层含核酸水相。下层有 机相，分界处蛋白质
•沉淀、离心分离:乙醇、异丙醇等
•保存：DNA-EDTA溶液、RNA-0.3M NaAc 75%乙醇
• 分离纯化核酸总的原则： ——应保证核酸一级结构的完整性； ——排除其它分子的污染
• 为了保证核酸结构与功能的研究，完整的 一级结构是最基本的要求，因为遗传信息 全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结 构还决定其高级结构的形式以及和其它生 物大分子结合的方式
核酸的纯化应达到以下三点要求
1.核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机 溶剂和过高浓度的金属离子； 2. 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降到最低程度； 3. 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分 子时应去除RNA，反之亦然
体外DNA重组，经目的基因插入高拷贝的质粒载体并通过 转化宿主细胞，进行复制
外界环境因子胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适 应性反应，从而导致相应的保卫基因产生明显的扩增
程序基因扩增有时也会被真核生物细胞作为在特定的发育 阶段合成高水平基因产物的手段，如在非洲爪蟾卵子形成 过程中的rRNA基因的扩增
医学分子病毒学实验
病毒核酸的提取、扩增
（逆转录-聚合酶链反应扩增病毒基因片段）
内容
DNA -PCR RNA -Reverse Transcription-PCR
*与Quantitative Real-Time PCR（qPCR）区别 ‘MIQE guideline’
核酸的扩增
体外应用聚合酶链式反应技术与合成寡核苷酸引物，导致 特定基因的拷贝数发生大量扩增
在生物的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关 的基因在基因组上成簇
PCR聚合酶链反应
体外DNA多聚酶介 导下促使特定核Байду номын сангаас片 段合成的一种方法
三个步骤：高温变性、 低温退火、适温延伸
材料：模板DNA、 寡核苷酸引物、 DNA聚合酶、Mg2+、 合适的缓冲体系、 dNTPs等
PCR的特点