病毒DNA提取

小鼠血浆中HSV-1 DNA的提取

[目的] 掌握血浆中病毒DNA 提取的原理，熟悉其提取方法。

[原理] E.Z.N.A.®Viral DNA Kit

该试剂盒提供了从小于250ul血浆、血清、无细胞培养液等样品中快速简单地提取病毒DNA的方法，液体样品经Buffer BL和蛋白酶（OB）消化后，经乙醇调节结合条件，过柱吸附DNA，再经过两步快速洗涤后，最后用Elution Buffer (10mM Tris,pH8.5)溶解基因组DNA。纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等实验。

[试剂及仪器]旋涡混合振荡仪；微量DNA定量仪；台式离心机；65℃水浴锅。

1.5ml无菌EP管（2个/人）；EP抗凝管(含100ul抗凝剂)（K）；1000ul枪及枪头；。Hibind DNA 结合柱(1个/人)；2ml收集管（3个/人）；OB蛋白酶（OB）；Buffer B L（含线性丙烯酰胺）(BL)；乙醇(乙)；Buffer HB(HB)；DNA Wash Buffer（W）；Elution Buffer(EB)。

[实验步骤]

一、血浆样品的制备：

1.用微量加样器取100ul抗凝剂加入1.5mlEP管中。

2.右手抓起小鼠尾巴，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子迅速摘除

眼球，将流出的血液滴入含有抗凝剂的1.5ml EP管中，迅速混匀后，10000rpm，离心3min。

上层黄色透明的即为血浆。

二、DNA的提取

1.取血浆250ul（如不足250ul，用Elution Buffer补足250ul）于1.5ml无菌EP管中。

2.加入10ul OB蛋白酶和250ul BL Buffer（含4ul线性丙烯酰胺用于填补病毒DNA在吸附

柱上的本底吸附），于旋涡混合振荡仪上最大速度振荡15sec。

3.65℃孵育10min。孵育过程中，用旋涡混合振荡仪混匀一次。

4.加入260ul乙醇，旋涡混合振荡仪最大速度振荡20sec。12000×g离心10sec，使盖子上的

液体沉于管中。

5.将Hibind DNA结合柱装在2ml收集管中，将第4步离心的上清中所有液体（约760ul）

加入Hibind DNA结合柱装上，8000×g离心1min。卸下收集管，将收集管及其中的液体弃去。

6.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入500ul HB Buffer，8000×g

离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。、

7.向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，卸下收集管，将收集管及其中

的液体弃去。

8.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，

8000×g离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。

9.将空的Hibind DNA结合柱15000×g离心2min，以去掉其中残余的液体。卸下收集管，

将收集管及其中的液体弃去。----这一步非常重要

10.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的无菌1.5ml EP管上（事先做好标记），加入50-100ul

65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min后，8000×g离心1min，洗脱液中即含有病毒DNA。

三、DNA定量：

微量DNA定量仪。取1.5ul用于DNA定量。

[结果] DNA浓度（ng/μl）=

A260=1.0， ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml

DNA纯度判定：

1. A260 / A280>1.8 85%-95%

<1.8 蛋白或酚类污染

2. A260 / A230>2

<2 碳水化合物，多肽，苯酚污染

注意事项：

1.染毒动物及物品的处理：

2. 抗凝剂：

（1）EDTA是极大多数（降解DNA的）脱氧核糖核酸酶的强烈抑制剂，建议抗凝剂使用EDTA，终浓度一般为50～100 mmol /L。

（2）ACD抗凝剂，每100ml中含0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠和1.47g葡萄糖，用作抗凝时每6ml新鲜血液中加入1ml ACD。

（3）一般不用肝素抗凝。