2 基因组DNA的提取与分离

酵母—破壁酶或液氮研磨
植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵 碾制成粉状）
动物组织—匀浆或液氮研磨
核酸分离纯化
DNA与蛋白质的分离
1.DNA与蛋白质的分离
SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与 蛋白质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放 出DNA。
简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生 物的因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和 DNase等酶，防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。
采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀， 但动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速 和时间。
沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用 时取出。
动物
小牛胸腺 肝脏
来源
植物 微生物
鱼类精子 幼苗 种子胚胎 谷氨酸菌体（ 7%~10%） 面包酵母（4%）
啤酒酵母（6%）
大肠肝菌（9%~10%）
许多病毒的DNA分子长度超过100kb，细菌DNA为 几千kb，高等动植物的基因组DNA长度达到上亿kb。
二、分离纯化核酸的总原则
保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引 起的降解。
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四、实验步骤
本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系 统提取细菌的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材 料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其 他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。
五、琼脂糖凝胶电泳法测定DNA分子大小
如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。 沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵
等盐类促进沉淀。 获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、
无机盐等。
基因组DNA提取注意事项 使用新鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸
提取量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐2-4 mL）。
纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白 质、多糖和RNA等）。
得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。
三、基因组DNA提取的原理
准备适宜的材料
裂解细胞，释放DNA 核酸分离纯化
去除蛋白质、 RNA等杂质
沉淀并吸附核酸
核酸溶解（缓冲液）
细胞破碎
化学法、机械法、生物法
细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制 DNA酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破 坏细胞膜）
详见实验课件：DNA的琼脂糖凝胶电泳
图1 E. coli JM109基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复 合物，在高盐溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到 0.3M 时，可沉淀CTAB-核酸复合物。（植物）
2.蛋白质的去除
苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA 溶于上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可 减少抽提过程的泡沫产生。
电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作 用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂 糖凝胶电泳。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电 泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同 的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离 后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。
实验1 大肠杆菌基因组DNA 的提取与分离鉴定
理论介绍
一、内容提要
基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从 不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内 的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程 度也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，与蛋 白质结合构成染色体，原核生物的DNA不与任何蛋白质 结合。
核酸分离纯化
RNA的去除
用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。 添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽
提，离心除去蛋白质及寡核苷酸。
沉淀并吸附核酸
含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水 乙醇沉淀。
基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中， 可用吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉 淀附在壁上及底部。