等温核酸扩增技术进展

等温核酸扩增技术进展等温核酸扩增技术已广泛应用于生物分析的体外核酸扩增，本文综合国内外报道，对等温核酸扩增技术的进展进行简要综述，包括依赖核酸序列型扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）、单引物等温扩增（SPIA）、交叉引物等温扩增（CPA）、新型等温多自配引发扩增（IMSA）的原理、重要特性、应用及未来的展望。

核酸基于其生物特性被用来作为生物研究和医疗诊断的重要生物标志物。

聚合酶链式反应（PCR）是第一个也是最受欢迎的用于扩增及低丰度检测核酸扩增技术。

尽管PCR技术被广泛地应用到各个领域，但他需要反复的热循环及精密仪器的缺点限制了其在资源有限或实地分析中的应用。

近年来出现及迅猛发展的等温核酸扩增技术有望成为未来发展的新趋势，因为其只需恒温装置（例如：水浴锅），便能进行快速且高效的扩增反应。

从20世纪90年代始，很多等温核酸扩增技术被发展起来，多种等温扩增方法都具有高灵敏度，而且有部分技术已成功转向商业化[1]。

在众多的等温扩增技术中，环介导等温扩增技术应用范围较为广泛，其他的等温扩增技术还有依赖核酸序列型等温扩增、链置换等温扩增、滚环等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物等温扩增。

本文综述了这些等温扩增技术及其在分子诊断的应用，并探讨等温扩增技术的发展及前景。

2 等温核酸扩增技术2.1 依赖核酸序列型扩增技术依赖核酸序列型扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）[2]，是一种基于转录依赖扩增系统建立起来的等温扩增技术。

NASBA通过模拟逆转录病毒复制方式设计而成，用于扩增单链RNA序列。

NASBA的基本原理是模板RNA被反义引物识别，并在逆转录酶的RNA依赖型DNA聚合酶活性作用下形成互补DNA链，而RNA-DNA复合体被核糖核酸酶H（RNase H）处理，使得原来的RNA链被降解，接着在逆转录酶的DNA依赖型DNA聚合酶活性作用下，含T7启动子的特异引物（oligdNTP）识别新合成的单链DNA链，形成含T7启动子的双链DNA结构，该结构可作为随后循环扩增的底物。

T7RNA聚合酶能够使带T7启动子的DNA 链作为模板合成与原来RNA链序列相似的新的RNA链。

通常NABSA能在41℃条件下进行，经过1.5～2 h的扩增可将模板RNA放大至109倍，灵敏度与RT-PCR的相当。

NABSA的终产物可用凝胶电泳、实时荧光法、比色法及电化学发光法检测，FDA已批准使用NASBA技术在HCV和HIV-1等一些微生物的分子检测[3-4]。

2.2 链置换扩增技术链置换扩增技术（strand displacement amplification，SDA）在1992年首次由Walker等提出，與NABSA不同的是，SDA是依靠酶促反应进行的DNA体外核酸等温扩增。

其扩增过程需要经过DNA单链模板的准备、5’端3’端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应三个阶段。

理论上，SDA在37～40 ℃进行23次循环后，2 h内靶序列可得到108扩增[5]。

在SDA产物检测上Walker等将荧光技术与SDA结合，建立了SDA的荧光偏振（Fluorescence polarization，FP）检测方法。

Spears等[6]将荧光探针加入到SDA的循环阶段，建立了同步SDA荧光偏振（simultaneous SDA and FP detection）检测技术，并成功应用于沙眼衣原体检测。

有关学者将SDA与压电DNA传感器技术相结合，研制了SDA压电DNA传感器，并对33份临床样本进行铜绿假单胞菌检测，其结果与荧光定量PCR结果一致，且更快速、灵敏。

SDA技术也用于病毒RNA的检测，如Mehrpouyan等[7]用SDA技术建立了对HIV-1病毒的检测，SDA技术在结核病、基因诊断等方面也已有报道[8]。

2.3 滚环扩增技术滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式特定复制方式建立的等温扩增技术[9]。

RCA线性扩增是在DNA聚合酶作用下，环状DNA与引物结合后进行延伸，生成大量与环状DNA互补的重复序列的线状DNA单链。

指数RCA采用与环状DNA序列一致的第二种引物，此引物与线性RCA产物结合并酶促延伸，产物又作为第一种引物的模板进行反应，因此使产物能在短时间内呈指数扩增。

指数RCA也可用于非环状DNA的扩增。

RCA很明显的缺点是其线性RCA只能用于检测一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体等，而合成指数RCA锁式探针的成本高及检测时存在信号背景问题[10]。

RCA被用于扩增及检测DNA及RNA的单核苷酸多态性（SNPs）[11-12]，这是第一个完成从双螺旋DNA或者mRNA转变为单链DNA的检测方法。

目前已经用RCA技术发展了TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒。

在腫瘤的早期核酸检测和检测分析，RCA也是一个很有潜力的分析工具。

2.4 环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等于2000年首先提出的一种新的等温核酸扩增技术。

该法使用4条引物（外引物F3/B3、内引物FIP/BIP）来识别6个特异性DNA结合位点，以及链置换功能的Bst DNA聚合酶，来实现核酸的扩增检测。

LAMP扩增包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。

其基本原理是在目的双链DNA解链后，内外引物识别相应的位点，在Bst DNA聚合酶作用下延伸。

当外引物延伸至内引物处时可将内引物形成的链置换出来，而后形成一个哑铃样DNA结构。

该结构再不断被引物识别、延伸和扩增后最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物[13]。

LAMP扩增产物的检测方法多种多样，包括琼脂糖凝胶电泳法、浊度检测法、颜色判定法，而颜色判定法所用显色剂又分两类：一类是金属离子指示剂，如钙黄绿素、羟基萘酚蓝（HNB）、钙黄绿素和HNB的组合等；另一类是核酸染料指示剂，如SYBR Green I、GeneFinder和碘化丙啶等。

LAMP技术自开发以来，备受研究者的青睐，已经成为分子检测技术大家庭的佼佼者。

早在2003年，LAMP就用于微生物及病毒，如流感病毒H5的检测[14]，也被用于胚胎性别鉴定的检测[15]。

其应用领域广泛，还包括针对细菌[16]、寄生虫[17]、真菌[18]等致病原的快速检测。

而且，Eiken化学公司（http：//www.eiken.co.jp/en/product/index.html）生产了LAMP检测法的商业试剂盒。

2.5 单引物等温扩增单引物等温扩增（single primer isothermal amplification，SPIA）技术的扩增反应是由杂交引物结合至靶DNA的互补序列上开始的[19]，而在DNA聚合酶的作用下，杂交引物及靶DNA序列进行延伸。

随着引物的延伸，杂交引物（RNA—DNA引物）的5’端RNA片段被RNase H选择性地降解，以释放部分靶DNA序列上的结合位点，从而又可结合新的嵌合引物。

新的嵌合引物需与之前引物延伸的产物竞争，才能结合到互补DNA的靶序列上，从而替换延伸的5’端产物。

如此经过RNA降解、新引物结合、链置换的这一循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。

SPIA是首个用于全球基因组DNA扩增的方法，此法也可用于特定基因组序列和合成DNA序列的扩增[20]。

SPIA通过加入一种转录酶改良为Ribo-SPIA，后者也可用于全球及特定RNA的扩增[21]。

由于Ribo-SPIA只扩增原始的转录本，而非复制产物，所以其具有高度的保度，而且其能放大每个RNA原始转录本高达1万倍。

因此，SPIA可用于不同种类核酸的大量扩增，在临床研究中也常见[22]。

2.6 交叉引物等温扩增交叉引物等温扩增技术（crossing priming amplification，CPA）及其扩增机制是由杭州优思达公司于2012年提出[23]。

CPA 的扩增过程包括：带有交叉引物位点的扩增产物的产生、交叉引物的扩增、产物的产生。

在扩增过程中，Bst DNA聚合酶通过置换作用不断延伸交叉引物及置换引物，而产生固定的正向链5’端。

同时，在扩增中引物不断地杂交、延伸及扩增产物的自我杂交、延伸，而产生多个引物杂交位点从而加速整个扩增过程，扩增的终产物是单链、发夹样结构、双链DNA的混合物。

CPA广泛应用于分子诊断、检验检疫、生物医学研究等领域，但主要还是集中在引起人类疾病的病原微生物、食物中致病微生物的核酸检测及人类遗传性疾病相关基因的诊断上。

祁军等[24]应用CPA法检测沙门菌、志贺菌及疟疾等病原体。

有学者建立了应用于转基因生物检测上的CPA扩增法[25]。

2.7 新型等温多自配引发扩增技术新型等温多自配引发扩增技术（isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA）是中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所于2013年研发并申请专利的一种新型核酸恒温扩增技术。

IMSA利用6条引物特异性识别靶基因的7个位点，其扩增包括原始自我配对结构（SMS）的生成、基于SMA的自我循环扩增及最终形成的基于原始SMA衍生的长链C环样DNA双链结构或正在解链的C环样结构。

IMSA在扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构，使得随后循环扩增几率明显增加，继而使得扩增效率和检测灵敏度提升。

目前IMSA的应用还比较局限，Ding等[26]建立了人类肠道病毒71（EV71）及柯萨奇病毒A16（CV A16）的IMSA扩增法，其具有高特异性及高灵敏度（EV71灵敏度高达96.4%，CV A16灵敏度达94.6%，），灵敏度比LAMP法的还要高（EV71灵敏度91.1%，CV A16灵敏度90.8%）。

且该法亦无需热循环仪，操作简便、快速，具有很好的应用前景，值得引起重视。

3 展望伴隨着高效的扩增，等温核酸扩增技术可以作为便携式分子诊断发展的理想候选技术。

在过去的20年里，等温核酸扩增技术有着显著的进步。

尽管目前PCR 仍然是用于核酸扩增最为广泛的技术，但由于其需要热循环扩增仪及复杂的扩增程序，这些不足造成PCR实地应用困难并导致筛查成本的增加。

相比之下，等温扩增技术对于原始生物样本的应用范围更宽，在临床诊断的效能上两者相当或者说等温扩增技术更优于PCR技术。

等温扩增技术的优点还有，从样本的处理到后续的检测，等温扩增技术只需在一个小管里便可进行，以及其检测只需微量样本、检测快速。