稳定细胞系的构建
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Hale Waihona Puke Baidu
三、筛选
1、转染后转染后观察待细胞汇合80%时，吸去培养液，加入 最佳筛选浓度的G418筛选液，此后每两天换相同浓度6418 筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。 2、待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度换成维持浓 度(筛选浓度减半)。 3、继续培养细胞，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。 4、阳性克隆增大后，消化计数，用培养液稀释， 使细胞浓 度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个 细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释， 再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞 。接 种四小时后观察，对只有1个细胞的孔进行标计。
稳定细胞系的构建
一、筛选药物浓度的测定
1、G418的配制： 1gG418溶入1mlPBS中，再双蒸水到7ml，制成1mg/ml 浓度，过滤保存。 2、筛选浓度测定： 取24孔板接种细胞，待细胞长至汇合度80%~90%时吸取 培养基，PBS洗涤后加入筛选培养基。 筛选培养基G418的浓度梯度为0，200，300，400，500， 600，700，800，900，1000ug/ml，每浓度两孔，根据 细胞生长情况2~3天更换一次筛选液。 3、选定10~14天细胞全部死亡的最小浓度为筛选浓度，一半 浓度为维持浓度。
二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM 2000 1、转染前24 h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细 胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%— 90%的融合。 2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10% FBS，无双抗)。 3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6 uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度达到0.01ug/uL-0.04 ug/uL,轻轻混匀，室温作用5 min。 4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine 2000 4 uL至体积为50 uL，轻轻混匀，室温作用5 min 。
5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此 时单份体积为100 uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为（1:2， 1:1，1.5:1，2:1ug/ul）轻轻混匀，室温作用20 min。 6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液 (无FBS） 洗两次，加入400ul1640 (无FBS） 培养液。 7、逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来 回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染（500uL无 FBS1640培养液）和转染空白载体对照（4uL Lipofectamine 2000+496uL无FBS1640培养液）。 8、在细胞培养箱中孵育6 h，弃去培养液，加入1640培养液 (10%FBS) 培养48小时。
三、筛选
1、转染后转染后观察待细胞汇合80%时，吸去培养液，加入 最佳筛选浓度的G418筛选液，此后每两天换相同浓度6418 筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。 2、待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度换成维持浓 度(筛选浓度减半)。 3、继续培养细胞，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。 4、阳性克隆增大后，消化计数，用培养液稀释， 使细胞浓 度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个 细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释， 再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞 。接 种四小时后观察，对只有1个细胞的孔进行标计。
稳定细胞系的构建
一、筛选药物浓度的测定
1、G418的配制： 1gG418溶入1mlPBS中，再双蒸水到7ml，制成1mg/ml 浓度，过滤保存。 2、筛选浓度测定： 取24孔板接种细胞，待细胞长至汇合度80%~90%时吸取 培养基，PBS洗涤后加入筛选培养基。 筛选培养基G418的浓度梯度为0，200，300，400，500， 600，700，800，900，1000ug/ml，每浓度两孔，根据 细胞生长情况2~3天更换一次筛选液。 3、选定10~14天细胞全部死亡的最小浓度为筛选浓度，一半 浓度为维持浓度。
二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM 2000 1、转染前24 h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细 胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%— 90%的融合。 2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10% FBS，无双抗)。 3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6 uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度达到0.01ug/uL-0.04 ug/uL,轻轻混匀，室温作用5 min。 4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine 2000 4 uL至体积为50 uL，轻轻混匀，室温作用5 min 。
5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此 时单份体积为100 uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为（1:2， 1:1，1.5:1，2:1ug/ul）轻轻混匀，室温作用20 min。 6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液 (无FBS） 洗两次，加入400ul1640 (无FBS） 培养液。 7、逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来 回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染（500uL无 FBS1640培养液）和转染空白载体对照（4uL Lipofectamine 2000+496uL无FBS1640培养液）。 8、在细胞培养箱中孵育6 h，弃去培养液，加入1640培养液 (10%FBS) 培养48小时。