稳定细胞系的构建
稳定细胞系建立学习
置于 ３ ７℃、 ５ ％Ｃ Ｏ 当孔内贴壁细 ２ 的孵箱中培养过夜， 胞达到 ９ ０ ％～ ９ ５ ％时进行转染。在加入脂质体包被的 Ｄ Ｎ Ａ前 ２ｈ ， ６孔板中细胞培养液换为无血清培养基继 ｅ ｐ Ｇ ２细胞孵育期间， 用ｐ Ｈ７ ． ２ 续培养。在待转染的 Ｈ 的Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 分别将 ４μ ｇ 的ｐ Ｃ Ｉ ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １和 １ ０ ｌ 的脂质 ? ? μ 体（ ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ） 各稀释至 ２ ５ ０ ｌ ， 轻柔混合后， 室温下 μ
［ ３ ］
， 同时， 首次发现胰
［ ４ ］
ｄ ｒ １ ／ Ｐ ｇ ｐ 表达增高 岛素抵抗的肝癌细胞 ｍ ?
。藉此， 本
研究将携带人类全长 ｍ ｄ ｒ １ｃ Ｄ Ｎ Ａ重组表达质粒 ｐ Ｃ Ｉ ? ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １转入人肝癌 Ｈ ｅ ｐ Ｇ ２细胞， 成功地筛选出高效、 ? ｅ ｐ Ｇ ２ ／ ｍ ｄ ｒ １ ， 稳定且耐药机理明确的多药耐药细胞株 Ｈ 并测定了其生长曲线、 ｍ ｄ ｒ １ｍ Ｒ Ｎ Ａ和 Ｐ ｇ ｐ 的表达及 Ｐ ? ? ｇ ｐ 的功能等生物学特性， 为进一步研究肝癌细胞耐药 ｇ ｐ的关 机制及其逆转， 以及肝癌细胞胰岛素抵抗与 Ｐ ? 系提供理想的细胞模型。
１ 材料与方法
１ ． １ 材 料 １ ． １ ． １ 重组质粒与细胞 人肝癌细胞株 Ｈ ｅ ｐ Ｇ ２细胞 由兰州大学医学实验中心保存， 携带有人类全长 ｍ ｄ ｒ １ Ｃ Ｉ ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １由四川大学医学中心 ｃ Ｄ Ｎ Ａ的重组质粒 ｐ ? ? 构建和惠赠。 １ ． １ ． ２ 试剂 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎＲ ｅ ａ ｇ ｅ ｎ ｔ 、 质粒提取 ２ ３ （ Ｒ ｈ １ ２ ３ ） 、 低糖 试剂盒购自北京天根公司； 罗丹明 １ Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养 基 购 自 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公 司； 阿霉素（ Ａ ｄ ｒ ｉ ａ ｍ ｙ ｃ ｉ ｎ ，
稳定细胞系建立及注意事项
Generating stable cell lines in HEK2931.Prior to transfection, it is recommended that you linearize your pcDNA gene construct. Linearizing will decrease the likelihood of the vector integrating into the genome in a way that disrupts the gene of interest or other elements required for protein expression. Suitable restriction enzymes for linearization are: Bg lII, MfeI, Pvu I, Sca I => for further, check Invitrogen pcDNA3.1 literature2.Transfect cells in dishes of 6 cm diameter according to the protocol for transient transfection in HEK. About 16 hrs post transfection, exchange the medium to medium supplemented with 0.5 g/L of neomycin.3.Keep exchanging the medium every day for 7-10 days. This is the time needed for the neomycin to act on the nontransfected cells, which then detach and are washed away during the medium exchange. Once all cells have died in the dish of the negative control (nontransfected), you can proceed with the cloning.4.Take 4 - 6 (ore more) 96-well plates and fill them with 80 µl of neomycin-supplemented medium. You may pour the medium into a sterile round cell culture dish and use the multichannel pipette and filter tips in this process. Trypsinize the cells (allowing full separation of cells => no clumps!) and resuspend an aliquot of cells in a 15 ml falcon tube. Then make 1 or 2 serial dilutions (e.g. one in ten) and determine the cellconcentration with the cytometer. Check your dilutions until you can only count 1-5 cells in the cytometer: the accuracy of your dilutions is very important.5.Prepare a sufficient amount of a 3cells/20µl (150 cells/ml) dilution. Work fast and don't let the dilutions stand too long or the cells will form clumps. Distribute 20 µl to each well of the plates. Be sure that you constantly shake the cells in the medium (best done when having only few mililiters in a 50 ml falcon tube), in order to distribute them equally to the wells.6.Let the cells grow in the wells for about 2 weeks. It is useful, if you already mark the wells containing monoclonal colonies (derived from 1 cell) after a few days. About one week after plating, you can also add 100 µl of fresh neomycin-medium to each well to reestablish high neomycin concentration (it may get broken down with time) and prevent contamination.7.Once "big" colonies (about 1/6 of the well diameter) are visible, also by eye when viewing the wells from the bottom of the plate, and the color of the medium starts to change (typically after about 2 weeks), colonies can be screened for expression by ELISA. At this stage, expression values typically are between 0.05 and 0.2 µg/ml.8.Choose the best clones to transfer them to a 24-well plate: First, prepare the wells in the new plate with about 400 µl of medium. Thenaspirate the medium from the cells in the old wells and wash them with PBS, add trypsin (few 40 µls) and wait until cells have detached (about 1 minute). Gently resuspend the cells with the pipette. Add 80 µl of medium to the cells and transfer them to the fresh well. Let them grow and determine the protein-expression levels again once they have reached a suitable cell number. A the level of 24- or 6-well plates, it is also possible to make a first cryotube of each selected clone.9.Since expression levels depend on the cell number, it is hard to determine the best expressing clone at the level of 24- or 6 well plates. Thus, it is best to grow several candidates up to the 75 cm2 level. IMPORTANT:A.Be sure that you start expanding from monoclonal colonies in the96 well plates!! - In polyclonal mixtures, the not producing, but neo-resistant cells might have a selective advantage and grow more rapidly, what finally leads to a depletion of the producing cell population.B.During the process of clone selection, perform several ELISAs to be sure that you chose the clones with the consistently highest expression levels.C.Start making cryotubes as a back-up as soon as possible. Once you have decided on a good clone, make at least 20 cryotubes of it before considering protein production (expression might be transient).D.Be aware of fungi contamination.......。
稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞系的构建
稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞系的构建韩笑笑;刘丽雅;谭超月;李元;高君碧;韩丽萍【摘要】目的:通过表达荧光素酶的慢病毒载体感染TC-1细胞株,建立稳定表达荧光素酶的TC-1细胞株.方法:根据荧光素酶基因设计引物,PCR扩增获得目的基因,构建表达荧光素酶的慢病毒载体并包装重组慢病毒,感染TC-1细胞.嘌呤霉素加压筛选,鉴定.用双荧光素酶报告基因检测试剂盒及体外成像系统进行荧光素酶活性检测.结果:经检测证实细胞感染及筛选后,成功构建了稳定高表达荧光素酶的TC-1细胞.结论:获得荧光素酶稳定表达的TC-1细胞,转染效果确切,荧光素酶基因表达稳定.【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(053)004【总页数】4页(P429-432)【关键词】TC-1细胞;荧光素酶;活体成像;生物发光;宫颈癌【作者】韩笑笑;刘丽雅;谭超月;李元;高君碧;韩丽萍【作者单位】郑州大学第一附属医院妇科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州450052【正文语种】中文【中图分类】R711.74宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，主要病因是人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，其中HPV16、18是主要致病型[1-2]。
TC-1细胞为含有HPV16型E6/E7基因的小鼠肺上皮细胞，通过接种TC-1细胞于小鼠宫颈阴道黏膜，可构建宫颈癌动物模型，进行相关肿瘤实验研究。
荧光素酶(luciferase)报告基因作为一种常用的报告基因系统，在细胞中的背景非常低，生物荧光穿透力强，可用以标记肿瘤细胞，通过活体成像系统直接观察细胞在体内的生长、转移及对药物的反应等情况，并且能无创客观地对荷瘤模型的微小癌灶进行实时监测[3-4]。
为此，作者构建了表达荧光素酶报告基因的慢病毒并感染TC-1细胞，通过筛选建立稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞株，为下一步构建可靠、直观、方便、灵敏的宫颈癌动物模型及相关研究提供示踪细胞来源。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
稳转细胞系构建方法总结
稳转细胞系构建方法总结
稳定细胞系构建是生物学研究中非常重要的一部分，它可以用
于基因功能研究、药物筛选、疾病模型构建等多个领域。
稳定细胞
系的构建方法有多种，下面我将从多个角度对稳定细胞系构建方法
进行总结。
首先，稳定细胞系构建的关键步骤包括转染、筛选和鉴定。
转
染是将外源基因导入目标细胞中的过程，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法。
化学法包括钙磷沉淀法和脂质体转染法，电穿孔法则利用电脉冲使细胞膜通透性增加，病毒载体法则利
用病毒作为基因导入的载体。
转染后，需要进行筛选以筛选出含有
外源基因的稳定细胞系，通常使用抗生素筛选或者荧光蛋白标记等
方法。
最后，对所得到的细胞系进行鉴定，确认其是否稳定表达外
源基因。
其次，稳定细胞系构建的选择合适的细胞系也是非常重要的。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、Hela等，选择合适的细胞系可以
影响到后续的稳定细胞系构建和应用效果。
另外，稳定细胞系构建方法还需要考虑外源基因的选择和构建。
外源基因可以是编码蛋白质的基因、RNA干扰基因、CRISPR-Cas9系统等，根据研究的需要选择合适的外源基因进行构建。
此外，稳定细胞系构建的过程中还需要考虑细胞毒性、稳定性和表达水平等因素，以确保所得到的稳定细胞系能够稳定、高效地表达外源基因。
总的来说，稳定细胞系构建是一个复杂的过程，需要综合考虑转染方法、细胞系选择、外源基因选择和构建以及细胞系鉴定等多个因素，才能够成功地构建稳定细胞系。
希望以上总结能够对你有所帮助。
人源神经降压素受体_1稳转细胞系的建立及其应用
人源神经降压素受体-1稳转细胞系的建立及其应用张果1, 孙涛1, 刘慧娟2, 牛国君2, 徐峰1, 2*(1. 南开大学药物化学生物学国家重点实验室, 天津 300071; 2. 天津国际生物医药联合研究院, 天津 300457)摘要: 神经降压素受体-1 (neurotensin receptor-1, NTR1) 是G蛋白偶联受体家族的成员, 调节细胞内钙离子的水平。
NTR1与多种疾病的发生发展密切相关。
为寻找与NTR1相关的拮抗剂, 建立了稳定表达人源NTR1蛋白的中国仓鼠卵巢细胞系CHO/NTR1。
将重组质粒利用脂质体转染的方法转入CHO细胞, 加入G418抗生素进行筛选, 采用Western blotting和钙离子浓度检测来评判CHO/NTR1细胞系是否构建成功。
通过钙离子浓度检测, 可以得到NTR1的天然配体神经降压素 (neurotensin, NT) 的EC50值和NTR1的已知拮抗剂SR48692的IC50值。
结果提示, 人源CHO/NTR1稳转细胞系可以用来研究NTR1的生物学特征和进一步筛选NTR1的拮抗剂与激动剂。
关键词: CHO/NTR1; 钙离子浓度检测; 神经降压素受体中图分类号: R965.1 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014) 09-1273-06Establishment and application of human CHO/NTR1 system ZHANG Guo1, SUN Tao1, LIU Hui-juan2, NIU Guo-jun2, XU Feng1, 2*(1. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Nankai University, Tianjin 300071, China;2. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine, Tianjin 300457, China)Abstract: Neurotensin receptor-1 (NTR1), which can stimulate the intracellular cascade signal pathway, belongs to the large superfamily of G-protein coupled receptors. NTR1 is related to the occurrence and development of several kinds of diseases. In order to screen the inhibitors for the cancers associated with NTR1 protein, we established a CHO (Chinese hamster ovary) cell line in which human neurotensin receptor-1 was highly expressed. The method is to construct the recombinant plasmid which was lysed with the hNTR1 geneand transfect it into CHO cells. After selected with G418, the cell line was evaluated by Western blotting analysis and calcium flux assays.Through the calcium flux assays on FlexStation 3,we got the EC50 value of neurotensin peptide which is the natural NTR1 agonist, and the IC50 value of SR48692 which is the known NTR1 antagonist. The established human CHO/NTR1 cell line can be used to study the profile of NTR1 biological activity and further screen of NTR1 antagonists and agonists.Key words: CHO/NTR1; calcium flux assays; neurotensin receptorG蛋白偶联受体 (G-protein coupled receptors, GPCR) 是一类与G蛋白相互作用并跨膜传递信号的受体家族, 在细胞信号转导中具有重要作用。
稳转细胞系构建简单原理_概述说明以及解释
稳转细胞系构建简单原理概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞生物学和遗传学领域，稳转细胞系构建是一项重要的技术，用于研究基因表达、蛋白质功能以及疾病的发生机制等。
稳转细胞系构建是指将外源基因或RNA序列引入目标细胞系中，并使其表达并稳定地传递给后代细胞。
这项技术为科学家们提供了一个探索和理解生命活动的重要工具。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分对稳转细胞系构建进行概述和解释，介绍文章主要内容。
第二部分将详细介绍稳转细胞系构建的基本概念以及常用的方法。
接着，第三和第四部分将侧重于讨论关键要点一和关键要点二，并解释其原理、提供示例或案例分析，并对应用场景进行分析。
最后，在结论与展望部分，将对已述内容进行总结，并提出对未来发展的展望或建议。
1.3 目的本文的目的是向读者介绍稳转细胞系构建的简单原理，包括基本概念、构建方法和原理解释。
同时，通过讨论关键要点一和关键要点二的实例和案例分析，以及对其应用场景的分析，帮助读者更好地理解该技术在科学研究中的意义与应用。
通过本文的阅读，读者将能够对稳转细胞系构建有一个全面且清晰的认识，并为未来相关研究提供参考依据。
2. 稳转细胞系构建简单原理2.1 基本概念解释稳转细胞系是指通过基因转染或基因编辑技术，使得一种细胞在经过多代分裂之后，其特定基因的表达能够被持续稳定地维持。
这样的细胞系在科学研究和生物制药领域中具有重要的应用价值。
2.2 稳转细胞系构建方法构建稳转细胞系的方法主要包括基因转染、基因编辑和选择标记等步骤。
a) 基因转染：常见的基因转染方法包括质粒DNA介导的转染、病毒载体介导的转染以及利用脂质体或者聚合物等载体传递外源基因到目标细胞中。
b) 基因编辑：目前常用的基因编辑技术为CRISPR-Cas9系统，通过引入Cas9核酸酶和相应的寻找序列（sgRNA），实现对目标基因组进行特异性剪切、插入或敲除等修饰。
这种方法可以直接修改目标细胞内特定基因座位，从而实现特定功能蛋白的表达。
细胞系或细胞株的建立
、概念、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。
对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程（一）肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。
取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。
其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。
稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定
稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定吴香菊;李芳韬;陈蕾;丛晓燕;孙文博;于江;陈智;郭立辉;吴家强【摘要】试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础.根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况.IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍.且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异.证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)008【总页数】7页(P2074-2080)【关键词】Marc-145;CD163;稳定细胞系【作者】吴香菊;李芳韬;陈蕾;丛晓燕;孙文博;于江;陈智;郭立辉;吴家强【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,泰安271000;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东农业大学动物科技学院,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,泰安271000;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100【正文语种】中文【中图分类】Q813猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染[1-2]。
构建稳定的敲除和过表达的方法
构建稳定的敲除和过表达的方法
在生物学研究中，稳定的敲除和过表达是常用的实验方法，用于研究基因的功能和影响。
通过敲除或过表达特定基因，研究人员可以揭示该基因在生物体内的作用和相互关系。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，需要采用稳定的敲除和过表达方法。
下面将介绍一些构建稳定的敲除和过表达的方法。
1. 选择合适的载体，在进行敲除和过表达实验时，选择合适的载体是非常重要的。
常用的载体包括质粒、病毒载体和转基因动植物。
选择合适的载体可以确保基因的稳定表达和传递。
2. 优化转染条件，对于细胞实验，优化转染条件可以提高敲除和过表达的效率。
包括转染试剂的选择、转染时间和细胞密度等因素。
3. 使用适当的筛选方法，在进行敲除实验时，需要使用适当的筛选方法来筛选出敲除目标基因的细胞系。
常用的筛选方法包括抗生素筛选和基因编辑技术。
4. 确定稳定的过表达细胞系，在进行过表达实验时，需要确保
过表达基因的稳定性和可靠性。
可以通过PCR、Western blot等方法来鉴定过表达细胞系。
5. 确保实验重复性，为了确保实验结果的可靠性，需要进行多次重复实验，并对实验结果进行统计分析。
总之，构建稳定的敲除和过表达的方法是生物学研究中非常重要的一步。
通过选择合适的载体、优化转染条件、使用适当的筛选方法和确保实验重复性，可以确保敲除和过表达实验的准确性和可靠性，为研究人员揭示基因功能和相互关系提供可靠的实验手段。
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立摘要将 KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。
本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。
关键词 KIF5B-RET基因；慢病毒载体；肺癌细胞一、引言RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为独立的新的分子亚型[1]。
Cabozantinib等几种市售的多靶点激酶抑制剂均能抑制RET激酶活性[2]，但特异的小分子抑制剂需进一步研究开发。
慢病毒表达载体具有高转染效率，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，且长期表达。
本研究通过成功构建KIF5B-RET基因慢病毒载体，建立稳定表达 KIF5B-RET的肺癌细胞系，为药物开发及筛选奠定基础。
二、材料与方法1.材料慢病毒载体 pLenti6.3_MCS（图1）购自Invitrogen公司，KIF5B-RET融合基因质粒由本实验室保存。
293T细胞购自中科院上海细胞库。
限制性内切酶 PacI、AscI、T4 DNA ligase购自NEB公司。
Lipofectamine2000购自 Invitrogen 公司。
质粒提取、胶回收试剂盒购自Biomiga公司。
2. 慢病毒表达载体的构建及鉴定用PacI / AscI把质粒37℃酶切2小时，电泳回收后，用T4 DNA ligase连接回收的片段与载体。
取10ul连接产物转化感受态细胞DH5a。
涂平板挑取单克隆摇菌，质粒中抽试剂盒提取质粒。
3. 病毒包装取 293T细胞按照每个10cm的培养皿6x106个细胞数铺板。
第2天，取9ug PackagingMix和 3ug慢病毒质粒加入1.5ml Opti-MEM混匀。
取36ul lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，混匀后将3ml复合物加入到细胞中过夜，换用培养基后培养3 d，收获细胞培养上清，分装，－80℃保存。
细胞株构建cld
细胞株构建cld细胞株构建（Cell Line Development, CLD）是一个重要的生物学过程，它涉及通过克隆或通过有限传代将原始的、不稳定的或分化细胞系转化为稳定且可遗传的细胞系。
这些细胞系可用于进一步的实验研究、药物筛选、工业生产等。
以下是细胞株构建的详细步骤：一、选择合适的原始细胞系在进行细胞株构建之前，首先需要选择合适的原始细胞系。
这些细胞系通常来自患者的肿瘤组织、正常组织或实验室建立的细胞系。
选择原始细胞系时，需要考虑以下几点：1．细胞的来源和遗传背景：了解细胞的来源和遗传背景有助于我们更好地理解细胞的特性和行为。
2．细胞的稳定性和生长特性：稳定的细胞系是进行实验研究和药物筛选的关键。
因此，选择生长特性稳定、分裂速度适中的细胞系非常重要。
3．细胞的分化状态：分化程度低的细胞具有更强的增殖能力和多分化潜能，更适合用于构建细胞株。
二、进行克隆筛选克隆筛选是细胞株构建的关键步骤之一，其目的是从原始细胞系中筛选出具有稳定生长特性和分化状态的克隆。
通常采用有限稀释法或显微操作法进行克隆筛选。
1．有限稀释法：将原始细胞系稀释至一定浓度，接种到96孔板或其他适合的培养器具中，通过观察细胞的生长情况和分化状态，筛选出具有稳定特性的克隆。
2．显微操作法：在显微镜下操作，将单个细胞接种到培养皿中，通过观察细胞的生长情况和分化状态，筛选出具有稳定特性的克隆。
三、建立稳定细胞系经过克隆筛选后，得到的克隆需要进行传代培养以建立稳定的细胞系。
在这个过程中，需要不断监测细胞的生长情况和分化状态，确保细胞系的稳定性和可遗传性。
此外，还需要进行遗传学分析，如染色体数目和结构等，以进一步确认细胞系的稳定性。
四、细胞株的质量控制为了确保细胞株的质量和可靠性，需要进行一系列的质量控制实验，包括：1．生物学特性分析：了解细胞的生长特性、分化状态、染色体数目和结构等生物学特性。
2．基因组学分析：进行基因组学分析，如基因表达谱、基因突变等，以了解细胞的遗传背景和特性。
shrna稳转细胞株 构建 步骤
shrna稳转细胞株构建步骤
构建shrna稳转细胞株的步骤如下：
1. 设计并合成shrna。
2. 构建包含shrna的表达载体，常用的是慢病毒载体。
3. 包装慢病毒，这一步通常需要借助病毒包装系统完成。
4. 滴度测定，测定病毒滴度是制备稳定转染细胞株的重要步骤。
5. 慢病毒感染，将目的细胞与慢病毒混合培养，使病毒进入细胞并整合到宿主染色体中。
6. 筛选稳定表达细胞株，在感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液并加入筛选药物。
药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。
7. 鉴定稳转细胞株，对筛选到的稳定表达细胞株进行鉴定，验证其是否稳定表达目的基因。
以上步骤仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
稳转细胞系的构建方法
稳转细胞系的构建方法以稳转细胞系的构建方法为标题，写一篇文章细胞系是指从原始组织或细胞中获得的具有相同遗传特征和生物学行为的细胞的连续生长和传代。
稳转细胞系即指在细胞系中稳定表达外源基因的细胞系。
构建稳转细胞系是细胞和分子生物学研究中常用的技术手段之一，它可以为我们研究基因功能和细胞信号传导提供重要的工具。
构建稳转细胞系的方法有很多种，下面将介绍其中的几种常用方法。
1. 转染法转染法是最常见的构建稳转细胞系的方法之一。
它通过将外源基因导入到目标细胞中，使细胞表达该基因。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法等。
其中，化学法是最简单和常用的方法之一，它通过利用化学试剂将外源基因导入细胞内。
电穿孔法则是利用电脉冲使细胞膜发生短暂的孔洞，从而导入外源基因。
病毒载体法则是利用病毒作为载体将外源基因导入细胞内。
转染法的优点是操作简单，适用于多种细胞类型，但其缺点是转染效率低，稳定性差。
2. 质粒整合法质粒整合法是构建稳转细胞系的另一种常用方法。
该方法利用特定的质粒将外源基因整合到细胞染色体中，使其稳定表达。
常用的质粒整合方法包括选择性抗生素筛选法和荧光素酶报告基因法等。
选择性抗生素筛选法是将外源基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后将其导入细胞中，再通过选择性培养基对细胞进行筛选，只保留表达外源基因的细胞。
荧光素酶报告基因法则是将外源基因与荧光素酶基因连接在一起，然后通过荧光素酶活性检测来筛选表达外源基因的细胞。
质粒整合法的优点是构建的稳转细胞系稳定性较好，但其缺点是构建过程较复杂，适用细胞类型有限。
3. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，也可以用于构建稳转细胞系。
该技术利用CRISPR/Cas9系统的导引RNA和Cas9蛋白靶向编辑细胞染色体中的特定位点，使外源基因整合到细胞染色体中。
CRISPR/Cas9技术具有高效、精准和灵活的特点，使得构建稳转细胞系变得更加简单和快速。
SOX17_过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建
第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230603SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建黄少婷1,2, 李友1,2, 吴钊淳2, 何嘉文2, 廖科棋2, 李胜男1,2（1. 广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东湛江524002；2. 广东医科大学附属医院神经病学研究所，广东湛江524002）［摘要］目的目的：构建性别决定区Y盒17（SOX17）过表达慢病毒载体，使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。
方法：在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列，将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接，构建GV492-SOX17过表达重组质粒。
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌，克隆后测序。
将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中，转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。
将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组，空白组不作处理，GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞（感染复数＝100），10 mg·L－1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞，荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。
采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平，Western blotting 法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。
结果结果：GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp， GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。
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二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM 2000 1、转染前24 h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细 胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%— 90%的融合。 2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10% FBS，无双抗)。 3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6 uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度达到0.01ug/uL-0.04 ug/uL,轻轻混匀，室温作用5 min。 4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine 2000 4 uL至体积为50 uL，轻轻混匀，室温作用5 min 。
5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此 时单份体积为100 uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为（1:2， 1:1，1.5:1，2:1ug/ul）轻轻混匀，室温作用20 min。 6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液 (无FBS） 洗两次，加入400ul1640 (无FBS） 培养液。 7、逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来 回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染（500uL无 FBS1640培养液）和转染空白载体对照（4uL Lipofectamine 2000+496uL无FBS1640培养液）。 8、在细胞培养箱中孵育6 h，弃去培养液，加入1640培养液 (10%FBS) 培养48小时。
稳定细胞系的构建
一、筛选药物浓度的测定
1、G418的配制： 1gG418溶入1mlPBS中，再双蒸水到7ml，制成1mg/ml 浓度，过滤保存。 2、筛选浓度测定： 取24孔板接种细胞，待细胞长至汇合度80%~90%时吸取 培养基，PBS洗涤后加入筛选培养基。 筛选培养基G418的浓度梯度为0，200，300，400，500， 600，700，800，900，1000ug/ml，每浓度两孔，根据 细胞生长情况2~3天更换一次筛选液。 3、选定10~14天细胞全部死亡的最小浓度为筛选浓度，一半 浓度为维持浓度。
三、筛选
1、转染后转染后观察待细胞汇合80%时，吸去培养液，加入 最佳筛选浓度的G418筛选液，此后每两天换相同浓度6418 筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。 2、待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度换成维持浓 度(筛选浓度减半)。 3、继续培养细胞，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。 4、阳性克隆增大后，消化计数，用培养液稀释， 使细胞浓 度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个 细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释， 再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞 。接 种四小时后观察，对只有1个细胞的孔进行标计。