呼吸道标本采集和结果解读
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披膜病毒科 小RNA病毒科 腺病毒科 冠状病毒科 疱疹病毒科 细小病毒科 呼肠孤病毒科
病毒种 流感病毒 呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病 毒、人类偏肺病毒
风疹病毒 鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的部分型别 腺病毒 人类冠状病毒、SARS冠状病毒 单纯疱疹病毒、带状疱疹、EB和CMV 人类博卡病毒 呼肠孤病毒（1，2，3，4型）
González-Castillo J,et al.Rev Esp Quimioter.2014;27(1)：69-86
• 肺炎链球菌和嗜肺军团菌 的细菌抗原采用尿免疫层 析技术检测
• 肺炎链球菌抗原的敏感性 约大于60%，成人患者大 于90%
• 军团菌抗原检测的敏感性 大于90%
指南中强调：血培养至少送2套
11
上呼吸道感染标本的采集
病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙 及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧 光定量PCR结果
细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长 采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃
William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892
Diagnosis!
Diagnosis!
Diagnosis!
Medicine is a science of uncertainty and an art of probability.
真菌涂片或其他真 支气管抽吸物 菌染色方法
无菌杯或管，室温，2h
真菌培养
支气管肺泡灌洗液；
PSB 半 乳 甘 露 聚 糖 血清
促凝管，室温，立即送检
（GM）
支气管肺泡灌洗液
1-3 β-D 葡 聚 糖
（G）
无菌杯或管，室温，2h
20
老年CAP患者的病原学诊断方法
老年CAP患者的病原学诊断
血培养
染色法
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
病例1
• 男性，64岁 • 既往史：
• 心肌梗死2次 • 严重的充血性心力衰竭，行双侧
冠状动脉旁路移植手术 • 心脏移植（植入式心脏复律除颤
器）
• 症状：呼吸困难、干咳、低热 • 初步诊断：
• 支气管肺泡灌洗：无致病菌， 正常菌群（真菌和分枝杆菌）
• 在发热开始的24 h内进行血培养。 • 尽力保证在抗感染治疗前获得首份血培养标本。 • 同时经2个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床
意义。除外新生儿外，不建议只进行单套血培养（Ⅱ级）。 • 48-96 h后评估治疗效果，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取2套标
本（Ⅱ级）。 • 但对怀疑血管内的感染，则应该间隔一段时间取不同部位的静脉穿刺抽
极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应 用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技 能 • 涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨 别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可 以辨别出主要形态类型
American Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2)
Cillóniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346. 4
我国CAP的主要致病菌
• 2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致病菌，其次为肺炎 链球菌1
• 在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了 20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常 见的致病原2,3
• 混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多1
病原体检出率(%)
入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测
1.刘又宁 陈民钧 赵铁梅等. 中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31.
破解呼吸道感染病原学诊断 的困境：需要你我他
王辉 北京大学人民医院检验科 Email：whuibj@163.com
L.CN.MKT.GM.04.2016.5059
1
内容
呼吸道感染病原学 困境和挑战 可能的破解之道
22
The Three Most Important Elements in Practicing Medicine
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
标本的质量
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
标本的质量
In conclusion, sputum Gram stain is highly specific for the etiologic diagnosis of CAP and HCAP and useful in guiding pathogen-targeted antibiotic treatment
2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院 954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。 重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。
JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first 7 7
上呼吸道标本类型及适应症
8
上呼吸道感染标本的采集
手术， 抗菌药物
患者治愈
Seifert H. CID, 2009,48:S238-45
医院获得性肺炎（HAP）的微生物标本采集和送检要求
病原
检验项目
最优标本
转运要求；送检最佳时间
铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、 血培养
血培养
已经注入标本的培养瓶室
肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘
温下尽快送抵实验室。
质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦
呼吸样本培养
尿抗原检测
பைடு நூலகம்
• 2011年ERS/ESCMD指南建 议所有住院患者均应进行 血培养
• 北美指南建议对更严重的 患者进行血培养
• 血培养有助于确诊潜在的 肺炎病原体和根据分离病 原菌对疾病进行重新评估
• 对初始抗生素治疗方案调 整具有重要的影响作用
• 但同样的呼吸道标本缺乏 较高的预测
• 老年患者存在功能障碍： 无法获得可评价的痰液； 口咽定植的G-菌、金黄色 葡萄球菌和MDR菌较多
31
粒缺患者肺炎的致病菌
32
Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260–271
最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手
头清楚的事
王辉-实验诊断学
3
病原体检出率(%)
欧洲流调：CAP的主要病原体
• 肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位
N=1463
一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患 者,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。
29
涂片项目报告格式
普通细菌涂片及染色
30 30
痰培养标本质量情况
总数
不合格
儿科
9
7
内科
2620
1883
急诊
644
441
血液科
1501
1020
外科
397
267
妇产科
23
13
门诊
267
150
ICU
1215
557
13家医院，痰标本合格率不足50%
不合格率 77.78% 71.87% 68.48% 67.95% 67.25% 56.52% 56.18% 45.84%
去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4℃冰箱内，严禁-20 ℃冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检
支原体保存液
病毒采样拭子
12
细菌采样拭子
下呼吸道标本类型及适应症
13
下呼吸道标本类型及适应症
下呼吸道标本中， 痰&支气管镜标本 最为重要！
14
标本的质量
核酸类型 单股RNA 单股RNA
单股RNA 单股RNA 双股DNA 单股RNA 双股DNA 单链DNA 双链RNA
Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264-75. 6 6
北京市成人CAP监测网：病毒性肺炎27.5%
芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球 革兰染色
痰 ； 支 气 管 抽 吸 物 ；无菌杯或管，室温，2h
菌和MRSA、流感嗜血杆菌 定量或半定量需氧 支气管肺泡灌洗液；
和厌氧细菌培养 PSB；肺组织
肺炎链球菌 混合厌氧菌（吸入）
曲霉菌属
同上
革兰染色 培养
尿液
PSB标本 肺组织
无菌容器，室温，2h
无菌管；无菌容器放组织； 室温，2h
3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.
5
成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视
每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例 10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%
病毒科 正粘病毒科 副粘病毒科
血，有助于诊断持续性菌血症（Ⅱ级）。
Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英国指南 22
手册宣讲
“双抽四瓶”，每瓶8-10ml 标示“左侧”、“右侧” 无菌体液 如胸水等
23
痰标本在病原学诊断中面临的困难
• CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰 • 痰标本合格率较低，甚至送检唾液 • 培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响
Pathogen identified
Respiratory Viruses Influenza virus A Human rhinovirus Adenovirus Human metapneumovirus Parainfluenza virus type 1 Parainfluenza virus type 3 Parainfluenza virus type 2 Influenza virus B Human enterovirus Respiratory syncytial virus type A Respiratory syncytial virus type B Coronavirus OC43/HKU1 Coronavirus 229E/NL63 Parainfluenza virus type 4 Bocavirus
24
痰标本不同外观
唾液 脓痰
带血痰 粘液样痰
25
标本质量评估－痰涂片
唾液
Garbage in！
26
26
一个小调查
• 随机调查中国15家医院2014年痰标本数据
是否每份痰标本都涂片
是否每份痰标本都半定量培养
是
否
20%
27%
是
73%
否
80%
27
痰标本判读标准的比较
28
合格痰标本：吞噬很重要
WBC内吞噬：葡萄球菌
• 胸片：右下肺局限性密度影
肺癌？
Seifert H. CID, 2009,48:S238-45
微生物结果—条件致病菌感染诊断关键
• 血培养： • 初次：类白喉杆菌（皮肤污染） • 第二次：马红球菌 （免疫缺陷宿主的条件致病菌）
• 最终诊断：细菌性肺炎 • 治疗：红霉素，3个月，治愈
肺内肿块基本吸收
Patients n (%)
262 (27.5) 94 (9.9) 41 (4.3) 40 (4.2) 17 (1.8) 16 (1.7) 14 (1.5) 11 (1.2) 6 (0.6) 5 (0.5) 5 (0.5) 4 (0.4) 4 (0.4) 4 (0.4) 1 (0.1) 0 (0.0)
咽拭子的采集方法
用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）
9
上呼吸道感染标本的采集
咽拭子的采集
正确拿咽拭子的方法
错误拿咽拭子的方法
上呼吸道感染标本的采集
集鼻 拭
子 标 本 的 采
请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用力， 当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子
病毒种 流感病毒 呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病 毒、人类偏肺病毒
风疹病毒 鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的部分型别 腺病毒 人类冠状病毒、SARS冠状病毒 单纯疱疹病毒、带状疱疹、EB和CMV 人类博卡病毒 呼肠孤病毒（1，2，3，4型）
González-Castillo J,et al.Rev Esp Quimioter.2014;27(1)：69-86
• 肺炎链球菌和嗜肺军团菌 的细菌抗原采用尿免疫层 析技术检测
• 肺炎链球菌抗原的敏感性 约大于60%，成人患者大 于90%
• 军团菌抗原检测的敏感性 大于90%
指南中强调：血培养至少送2套
11
上呼吸道感染标本的采集
病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙 及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧 光定量PCR结果
细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长 采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃
William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892
Diagnosis!
Diagnosis!
Diagnosis!
Medicine is a science of uncertainty and an art of probability.
真菌涂片或其他真 支气管抽吸物 菌染色方法
无菌杯或管，室温，2h
真菌培养
支气管肺泡灌洗液；
PSB 半 乳 甘 露 聚 糖 血清
促凝管，室温，立即送检
（GM）
支气管肺泡灌洗液
1-3 β-D 葡 聚 糖
（G）
无菌杯或管，室温，2h
20
老年CAP患者的病原学诊断方法
老年CAP患者的病原学诊断
血培养
染色法
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
病例1
• 男性，64岁 • 既往史：
• 心肌梗死2次 • 严重的充血性心力衰竭，行双侧
冠状动脉旁路移植手术 • 心脏移植（植入式心脏复律除颤
器）
• 症状：呼吸困难、干咳、低热 • 初步诊断：
• 支气管肺泡灌洗：无致病菌， 正常菌群（真菌和分枝杆菌）
• 在发热开始的24 h内进行血培养。 • 尽力保证在抗感染治疗前获得首份血培养标本。 • 同时经2个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床
意义。除外新生儿外，不建议只进行单套血培养（Ⅱ级）。 • 48-96 h后评估治疗效果，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取2套标
本（Ⅱ级）。 • 但对怀疑血管内的感染，则应该间隔一段时间取不同部位的静脉穿刺抽
极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应 用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技 能 • 涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨 别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可 以辨别出主要形态类型
American Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2)
Cillóniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346. 4
我国CAP的主要致病菌
• 2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致病菌，其次为肺炎 链球菌1
• 在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了 20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常 见的致病原2,3
• 混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多1
病原体检出率(%)
入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测
1.刘又宁 陈民钧 赵铁梅等. 中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31.
破解呼吸道感染病原学诊断 的困境：需要你我他
王辉 北京大学人民医院检验科 Email：whuibj@163.com
L.CN.MKT.GM.04.2016.5059
1
内容
呼吸道感染病原学 困境和挑战 可能的破解之道
22
The Three Most Important Elements in Practicing Medicine
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
标本的质量
Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534
标本的质量
In conclusion, sputum Gram stain is highly specific for the etiologic diagnosis of CAP and HCAP and useful in guiding pathogen-targeted antibiotic treatment
2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院 954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。 重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。
JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first 7 7
上呼吸道标本类型及适应症
8
上呼吸道感染标本的采集
手术， 抗菌药物
患者治愈
Seifert H. CID, 2009,48:S238-45
医院获得性肺炎（HAP）的微生物标本采集和送检要求
病原
检验项目
最优标本
转运要求；送检最佳时间
铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、 血培养
血培养
已经注入标本的培养瓶室
肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘
温下尽快送抵实验室。
质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦
呼吸样本培养
尿抗原检测
பைடு நூலகம்
• 2011年ERS/ESCMD指南建 议所有住院患者均应进行 血培养
• 北美指南建议对更严重的 患者进行血培养
• 血培养有助于确诊潜在的 肺炎病原体和根据分离病 原菌对疾病进行重新评估
• 对初始抗生素治疗方案调 整具有重要的影响作用
• 但同样的呼吸道标本缺乏 较高的预测
• 老年患者存在功能障碍： 无法获得可评价的痰液； 口咽定植的G-菌、金黄色 葡萄球菌和MDR菌较多
31
粒缺患者肺炎的致病菌
32
Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260–271
最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手
头清楚的事
王辉-实验诊断学
3
病原体检出率(%)
欧洲流调：CAP的主要病原体
• 肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位
N=1463
一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患 者,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。
29
涂片项目报告格式
普通细菌涂片及染色
30 30
痰培养标本质量情况
总数
不合格
儿科
9
7
内科
2620
1883
急诊
644
441
血液科
1501
1020
外科
397
267
妇产科
23
13
门诊
267
150
ICU
1215
557
13家医院，痰标本合格率不足50%
不合格率 77.78% 71.87% 68.48% 67.95% 67.25% 56.52% 56.18% 45.84%
去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4℃冰箱内，严禁-20 ℃冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检
支原体保存液
病毒采样拭子
12
细菌采样拭子
下呼吸道标本类型及适应症
13
下呼吸道标本类型及适应症
下呼吸道标本中， 痰&支气管镜标本 最为重要！
14
标本的质量
核酸类型 单股RNA 单股RNA
单股RNA 单股RNA 双股DNA 单股RNA 双股DNA 单链DNA 双链RNA
Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264-75. 6 6
北京市成人CAP监测网：病毒性肺炎27.5%
芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球 革兰染色
痰 ； 支 气 管 抽 吸 物 ；无菌杯或管，室温，2h
菌和MRSA、流感嗜血杆菌 定量或半定量需氧 支气管肺泡灌洗液；
和厌氧细菌培养 PSB；肺组织
肺炎链球菌 混合厌氧菌（吸入）
曲霉菌属
同上
革兰染色 培养
尿液
PSB标本 肺组织
无菌容器，室温，2h
无菌管；无菌容器放组织； 室温，2h
3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.
5
成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视
每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例 10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%
病毒科 正粘病毒科 副粘病毒科
血，有助于诊断持续性菌血症（Ⅱ级）。
Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英国指南 22
手册宣讲
“双抽四瓶”，每瓶8-10ml 标示“左侧”、“右侧” 无菌体液 如胸水等
23
痰标本在病原学诊断中面临的困难
• CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰 • 痰标本合格率较低，甚至送检唾液 • 培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响
Pathogen identified
Respiratory Viruses Influenza virus A Human rhinovirus Adenovirus Human metapneumovirus Parainfluenza virus type 1 Parainfluenza virus type 3 Parainfluenza virus type 2 Influenza virus B Human enterovirus Respiratory syncytial virus type A Respiratory syncytial virus type B Coronavirus OC43/HKU1 Coronavirus 229E/NL63 Parainfluenza virus type 4 Bocavirus
24
痰标本不同外观
唾液 脓痰
带血痰 粘液样痰
25
标本质量评估－痰涂片
唾液
Garbage in！
26
26
一个小调查
• 随机调查中国15家医院2014年痰标本数据
是否每份痰标本都涂片
是否每份痰标本都半定量培养
是
否
20%
27%
是
73%
否
80%
27
痰标本判读标准的比较
28
合格痰标本：吞噬很重要
WBC内吞噬：葡萄球菌
• 胸片：右下肺局限性密度影
肺癌？
Seifert H. CID, 2009,48:S238-45
微生物结果—条件致病菌感染诊断关键
• 血培养： • 初次：类白喉杆菌（皮肤污染） • 第二次：马红球菌 （免疫缺陷宿主的条件致病菌）
• 最终诊断：细菌性肺炎 • 治疗：红霉素，3个月，治愈
肺内肿块基本吸收
Patients n (%)
262 (27.5) 94 (9.9) 41 (4.3) 40 (4.2) 17 (1.8) 16 (1.7) 14 (1.5) 11 (1.2) 6 (0.6) 5 (0.5) 5 (0.5) 4 (0.4) 4 (0.4) 4 (0.4) 1 (0.1) 0 (0.0)
咽拭子的采集方法
用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）
9
上呼吸道感染标本的采集
咽拭子的采集
正确拿咽拭子的方法
错误拿咽拭子的方法
上呼吸道感染标本的采集
集鼻 拭
子 标 本 的 采
请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用力， 当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子