志贺氏菌和致泻大肠埃希式菌的检验
致泻大肠埃希氏菌
3.
生化反应
生化反应十分活泼，是鉴定肠道菌的重要 依据。 乳糖发酵试验在初步鉴别肠道致病和非致 病菌时有重要意义，肠道致病一般不分解乳 糖，而非致病菌多数能分解乳糖。
鉴定中最重要的生化反应
乳糖发酵试验
肠道非致病菌（埃希菌属） 发酵乳糖、产酸产气＋
肠道致病菌（志贺菌属、
沙门菌属等）不发酵乳糖 —
4. 抗原构造复杂
在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑浊，而 后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。
培养特性
部分菌落可出现β溶血。 在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落。
在SS琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌
也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落。
在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落。
在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色。
肠产毒性大肠埃希氏菌 （Enterotoxigenic E. coli,ETEC）
引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻， 也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性， 一般2-3天即愈。致病因素是LT或ST，或两者 同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者 为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ETEC 主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参 考意义。
分类
肠杆菌科
埃希氏菌属
大肠埃希氏菌
致泻大肠埃希氏菌
肠道致病性大 肠埃希氏菌 EPEC
肠道出血性大 肠埃希氏菌 EHEC
产肠毒素大肠 埃希氏菌 ETEC
肠道侵袭性大 肠埃希氏菌 EIEC
致泻大肠埃希氏菌
致泻性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化 特性均与非致病的大肠埃希氏菌非常相似，以至难 以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差 异来区别。 在致泻性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人 的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感 染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害 畜牧业，降低畜产食品的质量。致泻性大肠埃希氏 菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其 人畜粪便污染的各种食品中分离出来。
大肠埃希氏菌实验室检验方法
大肠埃希氏菌实验室检验方法简介大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它可以引起多种疾病，包括食物中毒、泌尿道感染和肠道感染等。
因此，对大肠埃希氏菌进行实验室检验是非常重要的。
本文将介绍大肠埃希氏菌实验室检验的方法和步骤。
实验室检验方法大肠埃希氏菌实验室检验主要包括以下几个方面：1.样品采集：根据不同的检验要求，可以采集不同的样品，例如食物、水样、粪便等。
采集样品时需要注意避免污染和交叉感染。
2.样品处理：对于食物和水样，通常需要进行前处理步骤，如浸泡、稀释等。
对于粪便样品，可以直接进行处理。
3.培养方法：将样品接种到适当的培养基上，培养培养基通常包括富营养的琼脂、选择性培养基等。
大肠埃希氏菌喜欢在富含葡萄糖的培养基上生长。
4.鉴定方法：通过观察菌落形态、生理生化特性和抗生素敏感性等指标，进行大肠埃希氏菌的鉴定。
常用的鉴定方法包括免疫学方法、分子生物学方法和生化试剂盒等。
5.结果判读：根据鉴定结果，判断样品中是否存在大肠埃希氏菌。
根据不同的检验要求，可以进行定性或定量判读。
实验步骤下面是一个常见的大肠埃希氏菌实验室检验的步骤示例：1.样品采集：根据检验要求，采集相应的样品。
例如，如果是食物样品，可以使用无菌取样棒在食物表面轻轻刮取一些，然后放入无菌容器中。
2.样品处理：对于食物样品，可以将其浸泡在含有缓冲液的容器中，摇动一段时间，使菌落充分分散。
对于水样，可以进行适当的稀释。
3.培养方法：将处理后的样品接种到富含葡萄糖的培养基上，如MacConkey琼脂或EC琼脂。
根据需要，可以使用选择性培养基，如Eosin MethyleneBlue琼脂。
4.培养条件：将接种的培养基置于适当的温度和湿度条件下，一般为37摄氏度，培养时间通常为24小时。
5.菌落观察：观察培养基上的菌落形态，大肠埃希氏菌通常呈现为粉红色的菌落，具有金属光泽。
6.鉴定方法：根据需要，可以进行进一步的鉴定。
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验(三)
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验（三）5.4.1 沙门氏菌分型鉴定按GB4789.4举行。
假如判定为时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。
5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定 5.4.2.1 按GB4789.6和GB4789.36举行。
分别的菌株应当同时被同样的几个噬菌体裂解后，用分型噬菌体实验，这些菌株应当具有相同的裂解模式，同时测定IRTD噬菌体的裂解状况。
5.4.2.2 ，应有肠毒素实验的证明。
5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：实验阴性、无动力、产气或不产气(O124血清型亦可以为有动力、不产气)，靛基质实验阳性。
可进一步做豚鼠角膜实验，结果应当为阳性，质粒电泳应证实具有120～140MdaI大质粒，PCR实验证实具有ipaC或ipaH基因。
5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌O157:H7,典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，产酸并多数产气，阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。
PCR实验证实具有产志贺毒素基因strl,stx2和溶血毒素基因hly。
IRTD的E-2噬菌体裂解实验，能被IRTD的E-2噬菌体裂解(裂解程度包括从CL到少数几个噬斑)。
对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，根据5.4.2.3的程序举行鉴定。
5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌具有大肠埃希氏菌的典型生化特性，eαe基因(黏附屏蔽基因)的PCR实验为阳性。
产志贺毒素大肠埃希氏菌eαe实验也可为阳性。
EAF(黏附因子质粒基因)或物(菌毛捆绑形成基因)的PCR实验可进一步证明。
5.4.3 志贺氏菌分型鉴定 5.4.3.1 挑取上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集实验。
血清学分型鉴定结果见表3。
表3 噬菌体实验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的结果 5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌1～5型，先用福氏多价血清做凝集实验。
志贺氏菌的检测
志贺菌检测技术摘要：志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。
为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。
本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望。
关键词 : 志贺氏菌；检测技术；展望前言：志贺菌是引起食源性疾病的常见病原。
人体在感染后都可能出现恶心、呕吐、腹痛等症状,对于症状不典型者,极容易被误诊为沙门菌、致泻性大肠埃希氏菌或霍乱弧菌感染,影响治疗而导致慢性感染或带菌者,这一方面延误了患者的早期治疗,另一方面扩大了病原体的传播。
因此,迫切需要对病因进行准确而快速的诊断。
目前,包括我国在内的许多国家对这类致病菌的检验,大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法,步骤繁琐,检验周期长,远不能满足应对突发公共卫生事件上,及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高的要求。
正文志贺氏菌是一类兼性厌氧、不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌。
长约2～3μm、宽0.5～0.7μm、杆状或短杆状，不形成荚膜，无鞭毛，多数有菌毛；营养要求不高，能在普通培养基上生长；最适生长温度为37℃，最适 pH 值为 6.4～7.8。
志贺氏菌可分解葡萄糖，产酸不产气。
VP 实验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用柠檬酸盐或丙二酸盐作为唯一碳源。
志贺氏菌属细菌的抗原由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。
O 抗原可分为群特异性抗原和型特异性抗原，型特异性抗原可用于区别菌型。
K 抗原可以阻止O 抗原与相应抗血清的凝集反应[3]。
根据生化反应和O抗原结构的不同，志贺氏菌可以分为痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。
在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位。
随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。
其中最为常用的是分子生物学上的常规PCR检测。
志贺氏菌检验.
尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，
部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准
3.与现有已颁布的新版国家标准协调 统一
参考了已颁布的2008版国标，在样品 的前处理步骤，培养条件的选择，文字 描述等方面尽量 保持一致。
（一）增 菌 培 养
用志贺氏菌增菌液增菌, 41.5 ℃±１℃，16 h～20 h厌氧培养。
智能厌氧微需氧培养系统
（二）分 离 培 养
• 取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分 别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板 或R&F志贺氏菌显色培养基平板上 • 于36 ℃1 ℃培养20 h～24 h，观察各个 平板上生长的菌落形态 • 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
二、生物学特性
• （一）、形态与染色 • 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无 鞭毛 • • 2~3um*0.5~0.7um
（二）、培养特性
1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4 2、在普通琼脂和 SS平板上，能形成圆形、微凸、 光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落 3 、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
GB/T 4789.5-2003 标准不足处
1. 采用GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后
大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌, 检测
效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制
3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差
食品中致病菌大肠艾希氏菌的检测
食品中致病菌大肠艾希氏菌的检测食品中病原菌的检验主要包括食品原料及食品中各种病原菌的检验，如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌及毒素、巴氏杆菌等19种病原菌。
在此只介绍大肠希氏菌的检验，以掌握病原性大肠艾希氏菌检验的原理和方法。
病原性大肠艾希氏菌检验原理正常情况下，大肠艾希氏菌不致病，而且还能合成维生素B和K，生产大肠菌素，对机体有利。
但当机体抵抗力下降或大肠艾希氏菌侵入肠外组织或器官时，可作为条件性致病菌而引起肠道外感染。
有些血清型可引起肠道感染，已知的引起致病性大肠艾希氏菌有四类，即产肠毒素大肠艾希氏菌、出血性大肠艾希氏菌、肠道侵袭性大肠艾希氏菌和肠道致病性大肠艾希氏菌，后者主要引起新生儿的腹泻。
带菌的牛和猪是传播本菌引起食物中毒的重要原因，人的带菌亦可污染食品，引起中毒。
病原性大肠艾希氏菌检测方法一、增菌样品采集后应尽快检验。
以无菌操作称取检样25 g，加在225 mL营养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加灭菌砂磨碎。
取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶内，于36土1 ℃培养6 h。
挑取1环，接种于1管30 mL肠道菌增菌肉场内，于42 ℃培养18 h。
二、分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板;污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36土1 ℃培养18 h一24 h，观察菌落。
不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
三、生化试验1. 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁(TSl)或克氏双糖铁琼脂(KI)。
同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH 7.2尿素、琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。
以上培养物均在36 ℃培养过夜。
2. TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠艾希氏菌。
埃希氏大肠菌及检验
埃希氏大肠菌及检验一、定义：大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。
大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。
与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。
文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。
二、生物学特性：基本形态特征：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。
此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。
约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特征：由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。
（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。
（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。
此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
生化反应与血清学反应大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。
致泄大肠杆菌检验技术
致病性
一、致泄大肠埃希氏菌概况
污染途径：污染水源和土壤，进而污染食物；肉类食品乳制品；水产品等 感染途径：①肠道内感染：腹泻、食物中毒、肠热症；②肠道外感染：鼠疫（烈性
传染病）、泌尿道感染、 肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
二、致泄大肠埃希氏菌检测
检样
测大肠菌群 MPN
污染严重的 检样匀液
三、注意事项
根据以上生化试验和血清学试验结果作出报告。 （1）大肠杆菌在某些食品中的抵抗力（如含亚硝酸盐的咸食品）或对某些处理过程
的抵抗力弱于致病菌。当它与致病菌同时存在时，只有在食品受污染后要马上检验才 能保证大肠杆菌的计数结果与粪便的污染成正比例。 （2）典型的大肠杆菌IMViC试验结果为“+ + - -”或“- + - -”。该结果表示食品 已经被粪便污染，有传播肠道传染病的危险。
或
污染严重检样匀液
36±1℃， 18~24h来自鲜桃红色或微红色, 菌落中心呈深桃红 色,圆形,扁平,边缘 整齐,表面光滑,湿润
验证试验 TSI
二、致泄大肠埃希氏菌检测
或
氧化酶试验
革兰氏染色
标记氧化酶阴性、革兰氏染 色阴性杆菌可疑典型菌落
靛基质
pH7.2尿素琼脂
KCN肉汤
赖氨酸脱酸酶
动力试验
•TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌. •TSI底层不产酸或 H2S、KCN、尿素有任何一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。
一、致泄大肠埃希氏菌概况
生物学特性 致病性大肠杆菌与非致病性大肠杆菌在形态、培养特性及生化特性上是不能区别的， 只有用血清学方法按抗原性质来区分。 血清学特性：大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗 原(K)三部分组成。 ➢ O抗原：每一血清型只含有一种O抗原，以阿拉伯数字表示。 ➢ H抗原：一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原。一般认为与致病性无关，因此，一般 不需要进行H抗原的鉴定。 ➢ K抗原：又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据耐热性可把K 抗原分为A、B、L三类，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原。
志贺氏菌和致泻大肠埃希式菌的检验
麦康凯琼脂平板
EMB平板照片及原理
大肠杆菌
3、初步生化试验： • 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄 糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏， 经36℃培养18～24h，分别观察结果。 • 原理：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观 察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该 培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1， 只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使 斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触 空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质， 生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于 是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄 色。
二）其他检测方法
• • • • 脉冲场凝胶电泳 荧光菌球法 协同凝集试验 PCR法
三）检验操作要点
• 志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快 进行试验。 • 如24h内不能检验，样品应在冰箱内 • 长时间不能检验，放在低温冰箱内。
致泻大肠埃希氏菌及其检验
• 致泻大肠埃希氏菌 一、 生物学特性 俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周 生鞭毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
5、肠毒素试验
LT检测方法： 双抗体夹心法 双向琼脂扩散试验 ST 检测方法： 抗原竞争法 乳鼠罐胃试验
1）、双向琼脂扩散试验: 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作 共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放 一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂 中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园
第十一章 食品中食品卫生微生物的测定
志贺氏菌及其检验 致泻大肠埃希氏菌及其检验
志贺氏菌及其检验
食源性致病菌检验标准操作程序
食源性致病菌检验标准操作程序福建省疾病预防控制中心二〇一二年十一月一、生物样本检验标准操作程序（一）粪便样本的保存、运送和检测表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件培养基目标病原体温度细菌标本保存和运送1. Cary－Blair 所有食源性致病菌室温增菌液 1. 改良磷酸盐缓冲液小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 ℃2. mEC增菌肉汤EHEC O157:H7/STEC 37 ℃3. Preston肉汤弯曲菌微需氧42 ℃4. SBG增菌液沙门氏菌37 ℃5. 3%氯化钠碱性蛋白胨水弧菌37 ℃选择性分离平板1. Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、EAEC、志贺氏菌37 ℃2. XLD平板志贺氏菌37 ℃3. mCCD平板弯曲菌微需氧42 ℃4. 耶尔森氏菌选择性平板小肠结肠炎耶尔森氏菌25 ℃5. 科玛嘉O157:H7显色平板EHEC O157:H7 37 ℃6. 科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门氏菌37 ℃7. 科玛嘉弧菌显色平板TCBS平板弧菌37 ℃病毒标本 1. 采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒-20 ℃以下（二）检验方法与流程3（三）沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序1 范围本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。
2 检验程序沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。
图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序3 操作步骤3.1 标本收集标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。
最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。
肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。
肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。
所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。
新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。
3.2 分离培养3.2.1 直接分离培养新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD 和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。
07埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定
埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。
二、原理根据肠杆菌科的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等将肠杆菌科由属鉴定到具体种类。
三、标本不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。
四、试剂及器材革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、标准血清、玻片、接种针（环）、酒精灯等。
五、鉴定程序埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定标本增菌培养分离培养（SS、麦康凯）观察生长情况，挑可疑菌落革兰氏染色镜检：G—杆菌，氧化酶（—）纯培养（转种克氏双糖铁培养基）及做动力、靛基质、尿素、MIU肠杆菌生化编码管据结果初步报告血清学凝集试验（多价、单价进一步定属、分型）确定报告六、临床意义1、大肠埃希氏菌在肠道可分为致病性与非致病性，非致病性菌作为正常菌群存在，致病菌引起腹泻。
肠道作为致病菌外引起其他感染。
2、沙门菌可引起伤寒和副伤寒、败血症、食物中毒、肠炎等。
3、志贺氏菌多侵犯肠道引起菌痢。
七、全防护措施在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。
八、标本处理废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。
九、参考文献诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验(二)
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验（二）5.1 前增菌、增菌和分别 5.1.1 的前增菌、增菌和分别按GB4789.4举行。
在食品格业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。
食物中毒标本不应前增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.2 志贺氏菌的增菌和分别按GB4789.5举行。
没有厌氧培养条件的试验室可以采纳BCT增菌液。
食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.3 的增菌和分别按GB4789.6和GB4789.36举行。
食物中毒标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.2 噬菌体实验 5.2.1 培养基的预备养分琼脂平板(含琼脂1%～1.5%,为防止变形杆菌的扩散生长，可按0.02%量加入)，养分琼脂加热融化后，加入每个9cm平皿中20mL～25mL,放在水平台面上待其凝固。
翻转平板，在36℃±1℃培养箱内半开皿倒置约1h,或50℃±1℃培养箱内半开皿倒置约30min,以烘干培养基表面水分。
5.2.2 实验菌液的预备5.2.2.1 自挑选性琼脂平板上分离挑取2个以上典型或可疑菌落，检验时，挑取乳糖阴性产H2S或不产H2S的菌落，和乳糖阳性产H2S的菌落。
检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌落。
检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分离接种TSL半固体和养分琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H2S,不产气无动力的菌落。
下述两种办法可供制备实验菌液时选用。
5.2.2.2 办法一：将待检菌落接种于养分肉汤管内，于36℃±1℃培养14h～24h。
挑取此肉汤培养物1满环(约5uL),稀释于盛有1mL～2mL的养分肉汤管内，使成为1:200～1:400稀释菌液，含菌量约为1×106CFU∕mL。
5.2.2.3 办法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有1mL～2mL养分肉汤管内，含菌量约为1×106CFU/mL。
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葡萄糖半固体原理及结果。 三糖铁（TSI）琼脂试验的原理
2－志贺氏菌 3－沙门氏菌
4－大肠杆菌 Organism Test Result
1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假 单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
2、分离培养 • 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌 液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； • 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 • 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红 美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→ 肠毒素鉴定→报告
1、增菌培养 • 以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营 养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加 灭菌砂磨碎。 • 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。 • 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
量及剩余体质量,二者之比大于0.09阳性,0.070.09为可疑.
6、结果报告 • 根据以上生化试验、血清学试验和肠毒素试验结 果作出报告。 • 如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结 果； • 如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验 结果。
2、分离培养 • 强选择性平板：SS或HE • 弱选择性平板：麦康凯或无色透明，中等大小，光滑圆形菌 落
麦康凯琼脂和HE琼脂的区别
• 两者都选择性生长革兰氏阴性菌。 • MacConkey含胆盐及龙胆紫。加了乳糖和 中性红来辨别乳糖发酵菌，如果可发酵乳 糖，菌落为粉红色，不发酵为透明。 • Hektoen enteric 除乳糖发酵外，还可以区 分硫化氢。主要用来区分两类细菌：沙门 和变形杆菌不发酵乳糖，产硫化氢，黑色 克隆；志贺和鼠疫杆菌不发酵乳糖，不产 硫化氢，克隆透明。
二）其他检测方法
• • • • 脉冲场凝胶电泳 荧光菌球法 协同凝集试验 PCR法
三）检验操作要点
• 志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快 进行试验。 • 如24h内不能检验，样品应在冰箱内 • 长时间不能检验，放在低温冰箱内。
致泻大肠埃希氏菌及其检验
• 致泻大肠埃希氏菌 一、 生物学特性 俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周 生鞭毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
（二）临床症状 三、致病性：
A、急性细菌性痢疾： 急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。 B、慢性细菌性痢疾： 慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→SS、 HE平板分离培养→初步生化鉴定→最 后血清学鉴定→报告
1、增菌培养
培养基：GN增菌液 培养条件：36±1℃ 6—8h 当培养液出现轻微混浊即中止培养。 操作： 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液 的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以 8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌 砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其 乳化，于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生 长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中 止培养。
• 大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、 粉红色.
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征
EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌
3、生化检验 • 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁
琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这 些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿 素琼脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。 以上培养物均在 36℃培养过液。 • TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化 钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. • TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一 项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。
5、肠毒素试验
LT检测方法： 双抗体夹心法 双向琼脂扩散试验 ST 检测方法： 抗原竞争法 乳鼠罐胃试验
1）、双向琼脂扩散试验: 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作 共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放 一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂 中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园
（2）进一步的生化试验
5、进一步的生化试验： 葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 pH7.2的尿素 KCN生长 水杨苷和七叶苷的分解 -
已判定为志贺氏菌属 五项生化试验： 5%乳糖发酵 甘露醇 棉子糖 甘油发酵 靛基质试验
（3）生化分群
6、结果报告：
• 综合生化血清学试验结果判定菌群， 菌型，并做出报告。
志贺氏菌生长的结果（现象）： （1）斜面产碱仍为红色或粉红色； （2）底层产酸不产气，变黄色； （3）不产H2S，不出现黑色。 志贺氏菌在半固体培养基生长： 沿线生长，无动力。
下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培物； d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏 志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株， 可做血清学分型和进一步的生化试验。
第十一章 食品中食品卫生微生物的测定
志贺氏菌及其检验 致泻大肠埃希氏菌及其检验
志贺氏菌及其检验
• 志贺氏菌
一、生物学特性 1、革兰氏阴性杆菌 2、无荚膜、无鞭毛、 无 芽孢，有菌毛 3、需氧或兼性厌氧 4、易于在普通培养基上 生长 5、四个亚群
革兰氏阴性鲍氏志贺菌
志贺氏菌的菌毛
二、污染途径 • 即可产生内毒素，也可产生外毒素，是侵 入性细菌 • 传染源：食物、病人、粪便、苍蝇等 主要污染凉拌菜
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli
扫描照片
二、污染途径 • • • • 污染水源和土壤，进而污染食物 肉类食品 乳制品 水产品等
三、致病性 • 肠道内感染 腹泻、食物中毒、肠热症 • 肠道外感染
鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、
肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
四物 、学 微检 生验
• 必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
4、血清学试验 • 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的 琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大 肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清 和出血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试 验。 • 当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清 所包含的单价O血清做试验。 • 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一 单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。
4、血清学试验和生化鉴定试验 4、血清学分型：
• 凡凝为志贺氏菌，挑取三糖铁琼脂上的培养 物，做玻片凝集试验。 • 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K 抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后 再检查； • 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D 群血清分别试验。 • 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍 氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15 各型因子血清检查。 • 如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏 菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
麦康凯琼脂平板
EMB平板照片及原理
大肠杆菌
3、初步生化试验： • 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄 糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏， 经36℃培养18～24h，分别观察结果。 • 原理：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观 察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该 培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1， 只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使 斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触 空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质， 生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于 是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄 色。
发酵乳糖的某种肠杆菌
HE平板原理及反应
不发酵乳糖的某种肠道菌， 而且产生硫化氢，可能是沙 门氏菌 不发酵乳糖的肠道菌，可 能就是志贺氏菌
SS平板原理及反应 SS Agar (Salmonella Shigella Agar)
大肠杆菌或者别的发 酵乳糖的肠杆菌
是沙门氏菌。有黑色中 心。 如果没有黑色中心，就很 可能是志贺氏菌了
并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，
另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36±1℃经15～ 20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为 阳性，无沉淀带者为阴性。
2）乳鼠灌胃试验： 将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内,36度培养 24小时,离心,取上清夜,注入1-4日龄乳胃内,禁食 3-4小时,麻醉,取出肠管,称量肠管(包括积液)质