志贺氏菌和致泻大肠埃希式菌的检验

葡萄糖半固体原理及结果。 三糖铁（TSI）琼脂试验的原理
2－志贺氏菌 3－沙门氏菌
4－大肠杆菌 Organism Test Result
1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假 单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红 美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→ 肠毒素鉴定→报告
1、增菌培养 • 以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营 养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加 灭菌砂磨碎。 • 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。 • 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
5、肠毒素试验
LT检测方法： 双抗体夹心法 双向琼脂扩散试验 ST 检测方法： 抗原竞争法 乳鼠罐胃试验
1）、双向琼脂扩散试验: 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作 共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放 一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂 中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园
量及剩余体质量,二者之比大于0.09阳性,0.070.09为可疑.
6、结果报告 • 根据以上生化试验、血清学试验和肠毒素试验结 果作出报告。 • 如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结 果； • 如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验 结果。
志贺氏菌生长的结果（现象）： （1）斜面产碱仍为红色或粉红色； （2）底层产酸不产气，变黄色； （3）不产H2S，不出现黑色。 志贺氏菌在半固体培养基生长： 沿线生长，无动力。
下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培物； d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏 志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株， 可做血清学分型和进一步的生化试验。
并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，
另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36±1℃经15～ 20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为 阳性，无沉淀带者为阴性。
2）乳鼠灌胃试验： 将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内,36度培养 24小时,离心,取上清夜,注入1-4日龄乳胃内,禁食 3-4小时,麻醉,取出肠管,称量肠管(包括积液)质
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli
扫描照片
二、污染途径 • • • • 污染水源和土壤，进而污染食物 肉类食品 乳制品 水产品等
三、致病性 • 肠道内感染 腹泻、食物中毒、肠热症 • 肠道外感染
鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、
肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
四物 、学 微检 生验
2、分离培养 • 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌 液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； • 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 • 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
发酵乳糖的某种肠杆菌
HE平板原理及反应
不发酵乳糖的某种肠道菌， 而且产生硫化氢，可能是沙 门氏菌 不发酵乳糖的肠道菌，可 能就是志贺氏菌
SS平板原理及反应 SS Agar (Salmonella Shigella Agar)
大肠杆菌或者别的发 酵乳糖的肠杆菌
是沙门氏菌。有黑色中 心。 如果没有黑色中心，就很 可能是志贺氏菌了
（二）临床症状 三、致病性：
A、急性细菌性痢疾： 急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。 B、慢性细菌性痢疾： 慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→SS、 HE平板分离培养→初步生化鉴定→最 后血清学鉴定→报告
1、增菌培养
培养基：GN增菌液 培养条件：36±1℃ 6—8h 当培养液出现轻微混浊即中止培养。 操作： 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液 的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以 8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌 砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其 乳化，于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生 长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中 止培养。
二）其他检测方法
• • • • 脉冲场凝胶电泳 荧光菌球法 协同凝集试验 PCR法
三）检验操作要点
• 志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快 进行试验。 • 如24h内不能检验，样品应在冰箱内 • 长时间不能检验，放在低温冰箱内。
致泻大肠埃希氏菌及其检验
• 致泻大肠埃希氏菌 一、 生物学特性 俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周 生鞭毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
第十一章 食品中食品卫生微生物的测定
志贺氏菌及其检验 致泻大肠埃希氏菌及其检验
志贺氏菌及其检验
• 志贺氏菌
一、生物学特性 1、革兰氏阴性杆菌 2、无荚膜、无鞭毛、 无 芽孢，有菌毛 3、需氧或兼性厌氧 4、易于在普通培养基上 生长 5、四个亚群
革兰氏阴性鲍氏志贺菌
志贺氏菌的菌毛
二、污染途径 • 即可产生内毒素，也可产生外毒素，是侵 入性细菌 • 传染源：食物、病人、粪便、苍蝇等 主要污染凉拌菜
（2）进一步的生化试验
5、进一步的生化试验： 葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 pH7.2的尿素 KCN生长 水杨苷和七叶苷的分解 -
已判定为志贺氏菌属 五项生化试验： 5%乳糖发酵 甘露醇 棉子糖 甘油发酵 靛基质试验
（3）生化分群
6、结果报告：
• 综合生化血清学试验结果判定菌群， 菌型，并做出报告。
2、分离培养 • 强选择性平板：SS或HE • 弱选择性平板：麦康凯或伊红美蓝平板(EMB) 在工作中36±1℃培养 18—24h， • 菌落特征：无色透明，中等大小，光滑圆形菌 落
麦康凯琼脂和HE琼脂的区别
• 两者都选择性生长革兰氏阴性菌。 • MacConkey含胆盐及龙胆紫。加了乳糖和 中性红来辨别乳糖发酵菌，如果可发酵乳 糖，菌落为粉红色，不发酵为透明。 • Hektoen enteric 除乳糖发酵外，还可以区 分硫化氢。主要用来区分两类细菌：沙门 和变形杆菌不发酵乳糖，产硫化氢，黑色 克隆；志贺和鼠疫杆菌不发酵乳糖，不产 硫化氢，克隆透明。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4、血清学试验和生化鉴定试验 4、血清学分型：
• 凡凝为志贺氏菌，挑取三糖铁琼脂上的培养 物，做玻片凝集试验。 • 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K 抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后 再检查； • 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D 群血清分别试验。 • 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍 氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15 各型因子血清检查。 • 如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏 菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
• 大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、 粉红色.
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征
EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌
3、生化检验 • 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁
琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这 些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿 素琼脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。 以上培养物均在 36℃培养过液。 • TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化 钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. • TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一 项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。
麦康凯琼脂平板
EMB平板照片及原理
大肠杆菌
3、初步生化试验： • 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄 糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏， 经36℃培养18～24h，分别观察结果。 • 原理：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观 察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该 培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1， 只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使 斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触 空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质， 生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于 是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄 色。
• 必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
4、血清学试验 • 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的 琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大 肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清 和出血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试 验。 • 当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清 所包含的单价O血清做试验。 • 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一 单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。