核酸细胞化学

Feulgen反应

原理介绍

自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.

自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色

利用1M HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。

Feulgen反应步骤

标本需经固定后方可染色，Carnoy固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为6：3：1比例配制。固定后石蜡切片即可。尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定。用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。减少非特异染色，具体操作如下：

1．切片脱蜡入水；

2．用lmol/L HCl浸洗；

3．切片放人预热到60℃1mol/LHCi内6分钟，(固定的标本为10～15分钟．Susa固定的标本为18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)；

4．入室温lmol/LHCl洗；

5．蒸馏水洗；

6．人Schiff液，于室温暗处(或外包黑纸)30～60分钟；

7．人亚硫酸钠水溶液漂洗3次，每次1～2分钟；

亚硫酸钠水溶液配法：

10%NaHS03 5ml

1mol/L HCl 5ml

加蒸馏水至 100ml

8．蒸馏水洗；

9．脱水、透明、封固。

结果：细胞核内DNA染成紫红色

对照实验：

虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。为

减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验。可按上述步骤做平行对照实验，仅将第3步，即60℃

lmol/LHCl水解改为室温15分钟，其余与上述步骤相同，结果DNA应为Feulgen阴性反应。

Feulgen反应图

大鼠肾小体和肾小管细胞核呈nigert阳性反应，含紫红色反应产物

Feulgen方法应注意的问题

对照切片的制做

进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff 剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。

固定剂的选择

以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly 固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。

但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。

水解时间

Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。

Schiff试剂的作用

Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。

Giemsa染色法

MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。

2染液配制

I液的配制：

迈格染料 lg

甲醇 100ml

在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒人烧瓶中，加入其余的甲醇后置入37℃温箱4-6小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用。临用前取上液40ml，加纯甲醇20ml混合用作工作液。

Ⅱ液的配制：

姬氏染粉 0.6g

甘油 50ml

甲醇100ml

将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3-4小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。

磷酸缓冲液配制：1％磷酸氢二钠20ml，l％磷酸二氢钠30ml，加蒸馏水至1000ml，调整pH 6.4-6.8(用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳)。

3染色步骤

(1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。

(2)将I液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)滴盖涂片上，lO-30分钟。

(3)倒弃涂片上的I液，自来水漂洗干净。

(4)立即滴盖Ⅱ液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)在涂片上染色10-30分钟。

(5)倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净。

(6)趁湿加盖片或待干后镜检。

4染色结果

MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。

5MGG染色特点

染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可

保存十多年而不退色。MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。

苏木精-伊红（HE）染色

HE染色是一种以形态为基础,结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术,用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构.

碱性染料以离子键结合而被染色.苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色.伊红Y是一种化学

浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料.

一般染色组织切片厚度为3µm左右,中枢神经系统6～8µm,肾小球基底膜染色观察时要求1.5～2µm标准厚度.

染液制备：

1.苏木精染液

(1)称取0.5g苏木精、5.0g铵矾或钾矾和0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水中；

(2)加入30ml甘油和2ml冰乙酸充分混匀后过滤即成母液；