tasiRNA研究进展

在此次研究中，我们使用一个修饰过的人工合成的tasiRNA (syn-tasiRNA)系统来检测对tasiRNA形成很重要的T AS转录本的特征。不可译性能促进tasiRNA的形成，非编码序列能用来人工合成T AS基因（Montgomery et al., 2008b）。然而翻译是怎样影响tasiRNA形成的还没有被系统的研究出来。通过将一段syn-tasiRNA cassette插入到编码区和编码蛋白质的基因（HT A6–GFP）的3`UTR不同位点，我们确定了翻译是怎样抑制tasiRNA形成的。结果与之前的预测恰恰相反，结果表明翻译能促进tasiRNA的形成。当syn-tasiRNA cassette 插入到紧跟终止密码子之后（construct B），能观察到tasiRNA合成的最高的效率。与之作对比，将syn-tasiRNA cassette插入到终止密码子下游的16nt处（construct C）能够引起tasiRNA合成的大幅度降低。预测到绑定到3`UTR前面的15nt的RISCs仍然在核糖体途径中（Grimson et al., 2007; Bartel, 2009）。在这种意义上说，核糖体将会到达与重组体B 的转录本绑定的miR173-RISCs，而对于重组体C的转录本，核糖体在到达miR173靶位点边缘之前会游离出来。尽管确切的机制还是未知的，翻译机制和与miR173关联的RISCs 之间的相互作用可能在将3`切割产物加工进入tasiRNA过程中有正调控作用。当终止密码子和miR173靶位点之间的距离增加时，tasiRNA的形成会降低，当距离增加到13nt时会达到一个稳定的水平。这与之前发现的16nt稍微有点不同(Grimson et al. , 2007;Bartel, 2009)。最近一个使用全基因组核糖体足迹分析（Ingolia et al., 2009）表示核糖体能到达大约终止密码子之后7-10nt。这些新数据与我们的观察结果相一致。

最近研究发现真核mRNAs的最后大约50个密码子翻译效率最高(T uller et al., 2010)。这表明如果靶位点放置到这些位点核糖体有更好的机会来与miR173关联的RISC复合体相互作用。如果miR173的靶位点放在开放阅读框的中间（就像重组体A一样）核糖体几乎没有机会与miR173关联的RISC复合体相互作用。这种推测有助于解释为什么将syn-tasiRNA cassette插入到开放阅读框中间（重组体A和B+bT AG）效率会降低。内生的T AS基因为什么都是非编码的，这个问题促进我们去分析被miR173靶向的4个T AS转录本。我们发现每个转录本都有一个很短的开放阅读框(132–177 nt)，miR173的靶位点靠近终止密码子（终止密码子上游14–23 nt）(Figure S8)。这表明翻译涉及到miR173引导的从内生的T AS 基因的tasiRNA的形成。然而，没有试验证据表明这些内生的短的开放阅读框能被翻译。翻译是否对任何内生的T AS基因有影响仍需检测。此外，我们实验中用的过表达系统可能诱导次级siRNA的形成。以后的试验将设计成检测tasiRNA形成和核糖体/翻译活动的直接关联。

导入不成熟的密码子能够显著减少tasiRNA的形成。这个观察结果与矮牵牛花协同抑制研究中观察的结果非常相似(Napoli et al., 1990; Que et al.,1997)。协同抑制指的是与一个内生基因相应的一段编码序列的过表达导致转基因和内生基因都沉默的现象。作者发现早期的错误密码不会影响转基因的丰富度，但是他们能够显著减少协同抑制的频率和程度。被未知的miRNA或siRNAs所靶向的转基因mRNA可能会诱导tasiRNA的形成，并且能够靶向和使内生基因沉默。当早期的错误密码子被诱导，tasiRNA的形成受损，将会导致协同抑制水平的下降。支持这种可能性的是，在矮牵牛花的协同抑制过程中能够检测出phased siRNAs(De Paoli et al., 2009)。

一个有趣的现象是与表达重组体B的幼苗相比在表达重组体C,D或B+T AG的转基因幼苗中tasiRNA形成的抑制是与3`切割产物的过度积累有关的。这表明miR173引导的切割过程和把3`切割产物加工进入到tasiRNA是两个分离的过程。被miR173所联合的RISC 的切割过程并不是把3`切割产物加工进入tasiRNA形成途径所必须的。3`切割产物的积累可能也会指示在5 `→3`核酸外切酶XRN4的消化吸收过程中对5`末端的保护(Souret et al., 2004; Valencia-Sanchezet al., 2006).这个保护过程的效果是与功能性的靶位点与miR173末端之间表现出完美的互补性的观察结果是相关的。当靶位点突变成能诱发与miR173在末端

的错配（像是173mTb和173mTc）3`切割产物和tasiRNA都没有积累。这可以解释3`切割产物由于错配而不被保护，反而很快的被降解，因此能够阻止它们加工进入到tasiRNA的可能性。以前就知道把5`切割产物加工进入次级siRNA需要miR171的3`末端和它的靶基因的完美的互补(Moissiardet al., 2007)。在大多数植物miRNA和他们的靶基因之间呈现出高度保守的错配(Ronemuset al.,2006)。这种错配在alignments末端的频率多于中间。这种高度保守的错配的可能的作用是能阻止切割产物加工进入到siRNAs。再加上还需要22 nt sRNA的引发，这就解释了为什么大多数的miRNA靶向的转录本不能产生tasiRNA。这些观察结果可以暗示在种间形成的杂交生物体和异源多倍体中的次级siRNA的形成。在有分化的基因的植物中，次级siRNA的形成可能会由于在诱导siRNA或靶转录本中序列的变化而被干扰(Haet al., 2009)。

Syn-tasiRNA被提议作为一个有用的RNA干涉的工具(Montgomeryet al., 2008b)，但是其效率仍待提高。我们使用据Montgomery et al., (2008b)报道的相同的在syn-tasiRNA cassette 中的miR173靶序列，结果是tasiRNA靶向相同的PDS3 mRNA.然而我们研究中黄化现象和PDS3 mRNA降低的效率显著地提高。大多数T1幼苗在真叶出现之前完全黄化，类似于pds3突变体(Qin et al., 2007)。三个可能的原因被认为是有助于更高的效率。（Ⅰ）一个很强大的35s的启动子（Ⅱ）一个能利用烟草蚀刻病毒的翻译链来增强翻译过程的编码蛋白的基因(Carrington and Freed, 1990)更有效率的syn-tasiRNAs（Ⅲ）。综上所述，这次研究的结果对使用tasiRNAs设计有效的RNA干涉策略时很有价值的。