阳离子脂质体转染操作方法
脂质体介导转染方法
脂质介导的短暂表达
实验材料
哺乳动物细胞
试剂、试剂
质粒DNA完全培养基氯化铯DMEM
盒
仪器、耗材
培养皿培养箱聚苯乙烯管
实验步骤
1. 按5×105细胞/孔的量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37℃ 5%CO2培养箱中
培养过夜，直至细胞80%汇片。
（如果用100 mm 培养皿代替六孔扳，则培养细胞至80%
汇片，将所有数量扩大8倍）
2. 在聚苯乙烯管中配制DNA/脂质体复合物如下：稀释质粒DNA至1 ml DMEM-SF中，
在旋涡混合器上振荡1 s 然后加入脂质体悬液、再次旋起混匀。
在室温下温育5~ 10 min，
使DNA与阳离子脂质体结合。
3. 吸去DMEM-SF培养液，用1 ml 的完全DMEM-SF洗1次，吸去DMEM-SF。
对毎
个35 mm 孔中，直接在细胞上加1 ml DNA/脂质体复合物。
在37℃培养箱中温育3~5 h。
4. 往每孔细抱中加入1 ml 的DMEM-20完全培养液，在37℃培养箱中继续温育24~48
h。
5. 吸去完全DMEM/DNA/脂质体复合物，毎孔加入2 ml 新的DMEM-10完全培养液，
继续搵育24~48 h。
6. 收集细胞：用细胞刮于刮下细胞，或胰蛋白酶消化或冻融裂解细胞。
进行适当的表
达分析。
脂质体进行稳定表达。
阳离子脂质体基因转染
阳离子脂质体基因转染脂质体（lipofectinregeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤[方法一]：（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量）。
（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项发布日期：2010-11-13 21:29:08 浏览次数：338Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项众所周知，Invitrogen脂质体2000是广大老师所熟知的转染试剂，其特点：转染步骤快速简便（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕。
（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基。
我们介绍一下 Invitrogen脂质体2000的操作流程、注意事项等。
一、操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
3、对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
4、混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
5、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。
脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。
可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。
2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。
将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。
3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。
这一步主要是让脂质体与基因充分结合。
4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。
细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。
5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。
6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。
可以根据实验需要进行后续分析。
需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。
阳离子吸附核酸并用脂质体包裹原理
阳离子吸附核酸并用脂质体包裹原理阳离子吸附核酸并用脂质体包裹的原理是一种常用的核酸转染方法，广泛应用于分子生物学实验和基因治疗研究中。
它通过阳离子与核酸的静电相互作用力吸附核酸，并通过脂质体包裹提供一种稳定的载体系统，以便将核酸有效地引入细胞内。
阳离子吸附核酸的原理可以追溯到很久以前，早在19世纪末，科学家就发现DNA和RNA都带有负电荷。
而阳离子是带有正电荷的离子，它们能够与带有负电荷的DNA或RNA分子形成静电相互作用力。
这种静电作用力足以克服核酸分子之间的互斥力，使得阳离子能够有效地吸附在核酸分子上。
在实验中，常用的阳离子有聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（poly-L-lysine）等。
它们可以通过与DNA或RNA之间的静电相互作用力来形成稳定的复合物。
一旦形成复合物，阳离子便能够保护核酸分子不受降解酶的攻击，并提供一种较好的携带系统。
然而，直接将阳离子和核酸复合物引入细胞内并不是一种高效的转染方法，这是因为阳离子核酸复合物在溶液中往往呈现凝聚状态，且表面带有正电荷，容易与细胞膜上的负电荷结构相互作用，导致细胞吸附率低。
此外，由于阳离子和核酸复合物的固有性质，它们在细胞内的释放效率也不高。
为了解决这些问题，科学家们引入了脂质体包裹的策略。
脂质体是一种由磷脂双分子层构成的微小囊泡，在水溶液中形成二维胞外液态结构。
脂质体具有很强的亲水性和脂性，使得它们能够与胆固醇、磷脂酰甘油等成分共同组装成稳定的微粒体，形成一种内部为水相、外部为脂相的结构。
这种结构为核酸的靶向输送提供了良好的载体。
在脂质体包裹的过程中，一般会选择一种或多种阳离子和核酸形成复合物，然后将复合物与脂质体共同包裹。
这样，核酸可以被有效地包裹在脂质体内部，形成稳定的复合物。
同时，脂质体的外层也使得核酸能够更好地与细胞膜相互作用，提高核酸的吸附率和转染效率。
此外，脂质体还能够降解和释放核酸，进一步提高核酸在细胞内的效果。
总结起来，阳离子吸附核酸并用脂质体包裹的原理利用了阳离子和核酸之间的静电相互作用力，以及脂质体的包裹和传递能力。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
北京普利莱基因技术有限公司DOTAP真核细胞转染试剂使用说明说明书
DOTAP真核细胞转染试剂使用说明C1510描述：DOTAP是一种阳离子脂质体，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。
它以可靠性和高效性著称，是广泛使用的商品化转染试剂。
我们的DOTAP真核细胞转染试剂是由DOTAP 和中性辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液。
这种制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。
DOTAP可高效转染多种细胞，甚至在低浓度血清环境也可工作良好。
它属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，其转染效率高于Sigma公司的DOTAP单体转染试剂，与Invitrogen的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。
转染时只需将稀释的DOTAP试剂与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可加入细胞。
1ml DOTAP可转染100-500µg DNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。
颜色：清亮或略呈白色胶体溶液。
储存：4°C储存12个月。
切勿冻存。
适用：将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。
适用于大多数传代或原代细胞。
转染步骤：以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。
细胞准备：转染前一天传0.5-2x105细胞于24孔板内，加1ml正常培养基培养。
在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为DOTAP转染的最佳时机。
这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。
注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低制备转染复合物：对特定细胞类型来说，应该优化加入DNA(µg)和DOTAP(µl)比率和绝对量，参见后面附表。
推荐DNA和DOTAP 的初始比例为1:4。
DNA(µg)：DOTAP(µl)＝1:2～1:8转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。
细胞转染的方法有哪些？
细胞转染的方法有哪些？
1. 脂质体法。
中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。
带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。
阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。
2. 电穿孔法。
通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。
DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。
此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率高。
每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
3. 病毒介导的感染。
感染需要将目的基因克隆到特定的病毒体系中，经过包装细胞的包装得到改造后的病毒，再进行感染。
优点是转染效率特别高，尤其是难以转染的原代细胞、活体细胞。
缺点是构建病毒周期长，环节多，易出错，费用也高。
4，非脂质体转染。
最新的纳米聚合物转染试剂，如Entranster 试剂，纳米材料，细胞毒性小，转染效率高，渐渐成为各大实验室的首选转染试剂。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
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4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤
（一）准备材料
1.质粒：一般是由受体细胞胞浆抽提的质粒，其中含有DNA操纵因子、胞质蛋白等；
2.抗体：主要由混合物或单一蛋白质组成，用于鉴定质粒抗原性以及
抑制免疫反应；
3.细胞培养液：一般为包含细胞培养基和生长因子的混合物；
4.转染试剂：也称转染缓冲液，主要由多种物质，如阿拉伯胞浆清酯、卡夫培糖、酚红、多数体核酸等组成，用于载体细胞的传感和质粒的迁移。
（二）脂质体转染操作
1.取出细胞培养液，将受体细胞倒入培养管中，用浓度为0.25%（体
积比）的牛血清添加至8-10%，以细胞膜生长抗性抑制剂（如抗生素或吲
哚美辛）等抑制细胞膜的分裂，加以培养；
2.将培养液中的受体细胞的数量控制在2×105/ml以上，用酚酞红法
检测，检测结果达到要求后，把受体细胞从培养管中放入6 ml的离心管中，进行6000 g的离心；
3.将离心液放入新的容器中，把细胞抽出，再加入细胞稀释缓冲液
（以PBS或缓冲液为主，加入百维素或多数体核酸）至1×106/ml，离心5000 g；
4.将离心液抽出，用转染试剂缓冲液把细胞洗涤，再分别加入DNase I, 抗体和质粒，放入摇床中。
阳离子脂质体转染原理
阳离子脂质体转染原理阳离子脂质体 (Cationic liposome) 转染技术是一项常用的基因转染工具。
本文将介绍阳离子脂质体转染的原理、优势以及使用注意事项。
一、原理在阳离子脂质体转染中，阳离子脂质体作为载体将目标基因导入细胞。
其原理主要基于脂质体膜及其表面上的阳离子与细胞膜中的阴离子相互作用，从而形成一个稳定的脂质体-细胞复合体。
此外，脂质体通过包裹目标基因，可以提高基因在细胞内的稳定性和可达性，从而增加基因的表达效率。
具体地，脂质体根据其结构可分为正电荷和负电荷两种。
阳离子脂质体的化学结构为：两个羟基移去 H+, 用烃基取代的胆甾酸盐、甘油为脂头，两个线型长链烃基由酯键连接，为脂尾。
阳离子脂质体外表带有正电荷，因为两个正电荷会相互排斥，使其稳定性增加，可以与细胞膜上的负电荷组成电荷复合体，从而实现细胞内目标基因的导入。
二、优势1. 适用于广泛的细胞类型：阳离子脂质体可用于多种类型的细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞和微生物细胞等。
2. 转染效率高：阳离子脂质体可将目标基因高效地导入细胞，提高基因表达效率。
3. 非病毒载体：相比较病毒载体进行基因转染，阳离子脂质体具有较低的细胞毒性，并且对细胞的影响较小。
4. 易于生产和操作：阳离子脂质体制备简单，易于大规模生产，并且转染操作相对简单。
三、注意事项1. 选择合适的脂质体：不同的细胞类型对阳离子脂质体的稳定性和导入效率有不同的要求，因此需要针对不同的细胞类型选择适合的脂质体。
2. 选择合适的DNA量和浓度：过高的DNA量和过低的DNA浓度都会影响转染效率。
一般而言，脂质体和DNA的摩尔比应该在2：1至4：1范围内。
3. 环境影响：阳离子脂质体易受到pH值、离子浓度、温度等环境因素的影响，因此需要保持实验环境相对稳定。
4. 注意细胞毒性：虽然相对于病毒载体，阳离子脂质体的细胞毒性较小，但部分阳离子脂质体可能仍会对细胞造成一定的毒性影响。
因此需要在转染实验中控制好脂质体的用量和浓度，避免对细胞造成不必要的伤害。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA, siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的办法主要有以下几种： (1) 阳离子脂质体试剂在优化条件下，将阳离子脂质体试剂加入水中，可以形成极小的（大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上，以及带负电的细胞膜表面。
用法阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA一阳离子脂质体复合物。
被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。
(2) 磷酸钙共沉淀将氯化钙、RNA/DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含RNA 且微小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-RNA/DNA复合物黏附到细胞膜，并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的胜利至关重要。
在试验中用法的每种试剂都必需当心校准，保证质量，由于甚至偏离最优条件非常之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
(3）电穿孔法电穿孔通过将细胞裸露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜临时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于胜利的转染十分重要，由于过高的场强和过长的电脉冲时光会不行逆地损害细胞膜而裂解细胞。
普通胜利的电穿孔过程都陪同高水平（50％或更高）的毒性。
(4) DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。
通过用法DMSO或甘油获得的渗透休克，将DNA复合体导人细胞。
两种试剂都已胜利用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
(5）机械法转染技术也包括用法机械的办法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle)。
显微注射用法一根细针头将DNA, RNA或蛋白质挺直转入细胞质或细胞核。
基因枪用法高压microprojectile将大分子导入细胞。
汉恒生物-LipoFiter转染试剂中文说明书
LipoFiter TM 转染试剂操作说明保存条件：4℃保存，一年有效（避免反复冻融）。
LipoFiter TM 简介LipoFiter TM 脂质体转染试剂( LipoFiter TM Liposomal Transfection Reagent )是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。
LipoFiter TM 优点1、转染效率高，重复性好，操作简单。
2、无明显细胞毒性，用LipoFiter TM 转染细胞后，对于大多数细胞72 小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
3、LipoFiter TM 对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用，并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。
LipoFiter TM 使用说明1.细胞培养：以293T 细胞为例，转染前一天(20-24 小时) ~0.4×106 细胞(具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定)铺到六孔板内，使第二天细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
注1：汉恒生物LipoFiter TM 对细胞毒性极小，因此无需通过增大细胞汇合度来抵抗转染试剂毒性，我们实验证明，50%~70% confluent 时细胞的转染效率可以达到最优。
注2：其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作，其他培养介质如培养板，培养皿的详细细胞接1种数目请按照比例自行换算。
2.在进行下述转染步骤前，把六孔板每孔内换成新鲜细胞培养液。
培养液的体积约为2 ml。
注：其他培养介质培养液体积参见《各种培养介质下LipoFiter TM 转染DNA 详表》，抗生素、Glutamine 等对LipoFiter TM 转染并无影响。
如果LipoFiter 对目的细胞毒性较大，建议去除转染体系内的抗生素。
3.把LipoFiter TM 脂质体转染试剂轻轻混匀。
4.对于待转染的六孔板中一个孔的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入4 μg 质粒DNA（其他培养介质DNA 用量参见附表）到250 μl DMEM 溶液，用枪轻轻吹打混匀。
阳离子聚合物法转染步骤
阳离子聚合物法转染步骤阳离子聚合物法是一种常用的转染方法，用于将外源DNA引入目标细胞内。
该方法基于阳离子聚合物与DNA之间的静电相互作用，通过形成阳离子聚合物- DNA复合物来实现转染。
下面将详细介绍阳离子聚合物法转染的步骤。
一、制备DNA与阳离子聚合物复合物1.1 选择合适的阳离子聚合物阳离子聚合物应具有良好的DNA结合能力和细胞毒性低的特点。
常用的阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）、聚-L-赖氨酸（PDL）、聚（D-赖氨酸）（PDL）、聚-L-赖氨酸（PLLA）等。
选择合适的阳离子聚合物对于转染效率和细胞毒性有重要影响。
1.2 制备阳离子聚合物溶液将阳离子聚合物按照一定比例溶解在去离子水或缓冲液中，制备成一定浓度的阳离子聚合物溶液。
溶液浓度的选择应根据目标细胞类型、DNA浓度和转染效率来确定。
1.3 加入DNA将目标DNA按照一定比例加入到阳离子聚合物溶液中，并充分混合。
一般情况下，DNA与阳离子聚合物的质量比为1:1至1:10。
此时，阳离子聚合物通过静电相互作用将DNA包裹在其表面，形成阳离子聚合物-DNA复合物。
二、转染2.1 细胞处理将目标细胞培养在适当的培养基中，使其处于良好的生长状态。
细胞的密度和状态对转染效率有重要影响，应根据实验需要进行优化。
2.2 加入复合物将制备好的阳离子聚合物-DNA复合物加入到细胞培养基中，与目标细胞进行充分混合。
复合物与细胞通过静电相互作用结合，将DNA 引入细胞内。
2.3 孵育将转染后的细胞培养在适当的条件下，通常是37℃、5% CO2的细胞培养箱中，进行一定时间的孵育。
孵育时间的选择应根据转染效率和目标基因的表达特点来确定。
三、细胞分离与筛选3.1 细胞分离将孵育后的细胞进行分离，去除未转染的细胞或细胞残渣。
常用的分离方法包括胰蛋白酶消化法、细胞筛选法等。
3.2 筛选转染细胞通过添加适当的筛选剂来筛选转染细胞。
筛选剂的选择应根据目标基因的特点和转染载体的标记情况来确定。
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阳离子脂质体转染操作方法
阳离子脂质体转染是一种常用的基因传递实验技术，可以将核酸载体有效地转染至细胞内。
下面是阳离子脂质体转染的基本操作方法：
1. 细胞培养：选择适合的细胞培养基及条件，将要转染的细胞在培养皿中培养至指定的生长状态，通常是80%～90%的细胞密度。
2. 制备DNA-脂质体复合物：将目标DNA与阳离子脂质体以适当比例混合，制备成DNA-脂质体复合物。
复合物的制备条件可以根据实际情况进行优化，一般来说，将DNA与脂质体按照质量比1:3～1:5混合，在无菌条件下保持15～30分钟使其充分结合。
3. 转染：将DNA-脂质体复合物均匀滴加至细胞培养皿中，注意避免产生气泡，插入培养皿中心。
轻轻摇晃培养皿使其均匀分布，然后将培养皿放回密闭的培养箱中，继续培养。
4. 代谢酶抑制：在培养细胞转染后的前24小时内，添加代谢酶抑制剂（如10 μg/mL的氨基葡萄糖苷或10 mM的2-脱氧-D-葡萄糖）来提高转染效率。
5. 培养：根据需要的实验设计，继续培养细胞，通常在转染后24～72小时进行下一步的实验。
需要注意的是，每个细胞系对阳离子脂质体的适应性不同，因此在实际操作中需要进行不同的试验优化。
同时，与脂质体浓度、DNA浓度、转染时间等因素也需要进行优化。