转染步骤及经验(精华)

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细胞转染步骤

细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。

当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系:(6cm盘)2。

4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。

3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。

4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。

5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。

6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。

7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。

8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。

2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。

9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。

10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.所需物品:1。

转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。

24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6。

G418 7. 1mlHEPES液。

细胞转染步骤

细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。

这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。

在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。

下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。

第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。

其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。

RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。

第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。

要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。

常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。

第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。

制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。

转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。

接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。

转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。

第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。

这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。

2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。

3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。

4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。

以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。

在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。

细胞转染的技巧

细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。

本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。

细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。

目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。

一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。

常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。

在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。

2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。

一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。

3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。

过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。

二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。

电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。

在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。

2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。

3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。

三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。

病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。

细胞转染操作方法

细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。

常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。

其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。

二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。

2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。

3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。

4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。

5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。

三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。

2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。

3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。

4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。

5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。

若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。

四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。

2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。

3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。

4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。

5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。

五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。

实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。

脂质体转染操作步骤

脂质体转染操作步骤进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好。

1、细胞铺板（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%），从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。

（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。

（3）传代条件取决于所用的细胞系。

对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。

对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。

（4）转染当天，将细胞铺板。

如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。

转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。

2、细胞转染吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

更换无血清培养基。

准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。

以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。

加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。

质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率）。

质粒转化、细胞转染步骤

质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。

具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。

接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。

然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。

转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。

在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。

然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。

接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。

待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。

最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。

转染详细步骤大攻略【精选】

转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。

将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。

具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。

(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。

12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。

(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.二、转染操作流程（以常用地孔板为例）()细胞培养：取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).()转染液制备：在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.三、转染注意事项. 血清. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多..抗生素（）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量..细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售..细胞铺板密度用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，.启动子地选择获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.量高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高..瞬时和稳定表达及监测转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法..稳定转染细胞系地筛选连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数..蛋白表达和培养基地选择哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.。

转染步骤及经验（精华）

转染步骤及经验（精华）转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。

其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。

影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。

二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）（1）细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37C 5%CO2培养箱中培养至70%?90%汇合。

（不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞）。

（2）转染液制备：在EP管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量） A液：用不含血清培养基稀释1-10卩g DNA终量100 yL, B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100 uL轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL 不含血清及PS的培养液。

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37C温箱置6?8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

三、转染注意事项1.血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。

B?一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。

一般转染操作步骤

一般转染操作步骤
1、稀释转染试剂
将6ul转染试剂FuGENE加到装有90-98ul预热到室温培养基的无菌聚丙乙烯管中，立即混匀，室温放置5min。

注：勿将未稀释的转染试剂FuGENE碰到管壁，造成稀释不充分。

2、制备转染物
加2ug的质粒DNA至稀释的转染试剂中，立即混匀，室温放置15min。

注：勿超过45min，否则影响转染效率。

3、添加转染物至细胞培养液
将2-10ul的转染物加到含有100ul细胞培养液的96孔板中，轻轻吸打或者左右摇晃10-30S以充分混匀。

推荐：5ul作为起始点
4、孵育培养
置于CO2培养箱中，培养24-48h检测。

转染试剂FuGENE：DNA=3:1
质粒DNA浓度：0.2-1 ug/ul
96孔板每孔2-10ul转染物成分：0.15-0.6ul的转染试剂+0.04-0.2ug的质粒DNA。

转染实验报告原理

一、引言转染实验是分子生物学和细胞生物学领域常用的技术之一，主要用于将外源DNA或RNA分子导入细胞内，使其在细胞内表达，从而研究基因功能、基因调控等生物学问题。

本文将详细阐述转染实验的原理，并探讨其在生物学研究中的应用。

二、转染实验原理1. 转染过程转染过程主要包括以下几个步骤：（1）外源DNA或RNA分子的制备：通过PCR、化学合成或克隆等方法获得目的基因，并将其克隆到表达载体或报告基因载体上。

（2）转染试剂的选择：根据细胞类型和实验需求，选择合适的转染试剂，如脂质体、聚合物、电穿孔等。

（3）转染操作：将外源DNA或RNA分子与转染试剂混合，加入细胞培养液中，在一定条件下使转染试剂与细胞膜接触，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。

（4）基因表达：外源DNA或RNA分子进入细胞后，通过转录和翻译过程，使目的基因在细胞内表达。

2. 转染原理转染实验的原理主要包括以下几种：（1）脂质体介导的转染：脂质体是一种由磷脂分子组成的微小囊泡，具有生物相容性和靶向性。

将外源DNA或RNA分子与脂质体混合，通过脂质体与细胞膜的相互作用，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。

（2）聚合物介导的转染：聚合物介导的转染是通过聚合物与细胞膜相互作用，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。

常用的聚合物有聚乙二醇（PEG）、聚赖氨酸等。

（3）电穿孔转染：电穿孔转染是通过高电压脉冲使细胞膜产生短暂孔洞，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。

三、转染实验应用1. 基因功能研究转染实验可用于研究基因功能，如：（1）基因敲除：通过转染短发夹RNA（shRNA）或siRNA，使目的基因表达沉默，研究基因在细胞功能中的作用。

（2）基因过表达：通过转染表达载体，使目的基因在细胞内过表达，研究基因在细胞功能中的作用。

2. 基因调控研究转染实验可用于研究基因调控，如：（1）启动子分析：通过转染报告基因载体，检测启动子活性，研究基因调控元件。

（2）转录因子功能研究：通过转染转录因子表达载体，研究转录因子对基因表达的影响。

转染步骤范文

转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。

转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

以下是转染步骤的详细描述。

第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。

细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。

第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。

化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。

病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。

质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。

第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。

转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。

第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。

常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。

通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。

除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。

同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。

总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。

RNAinhibitor细胞转染实验步骤

RNAinhibitor细胞转染实验步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下RNA inhibitor转染步骤（24孔板）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。

如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的RNA mimic，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。

室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。

质粒转化细胞转染步骤

质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。

一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。

以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。

一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。

它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。

1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。

通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。

孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。

3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。

4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。

同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。

二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。

常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。

1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。

2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。

3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。

不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。

4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。

根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。

5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。

综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。

脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述

脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。

细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。

目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。

1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。

转染步骤

Lipofectamine 2000 转染试剂转染步骤（24孔板/6孔板）：一:瞬时转染(贴壁细胞)1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在500 μl/2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中(每孔0.5-2×105 /3×105 胞)。

使其在转染日能达到90-95％的融合。

2.对于每孔细胞，使用50ul/250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8ugDNA/ 4.0ugDNA，轻轻混匀。

3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用50ul/250 ul 无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基)稀释2ul/10ul Lipofectamine 2000转染试剂.轻轻混匀,室温孵育5分钟。

NOTE：Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟后同稀释的DNA混合（<30分钟）。

长时间孵育会降低活性.若使用DMEM培养基稀释，则需在5分钟内同稀释的DNA 混合。

4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）, 此时总体积是100 ul/ 500ul。

轻轻混匀,室温放置20分钟以使DNA- Lipofectamine 2000复合物形成。

溶液可能会比较浑浊,但这不影响转染效率. DNA- Lipofectamine 2000复合物室温放置6小时都比较稳定.5.（optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

加入0.5ml/2ml无血清配养基。

6.逐滴加入100 ul/500ul 脂质体/DNA混合物到每孔中（从培养孔一边到另一边），边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀。

中孵育24-48小时。

无需去掉复合物或更换培养基。

或者在7.在37℃，5％CO24-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。

8.在细胞中加入复合物24-72小时后，荧光镜下观察转染效率, 分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测各项指标。

转染步骤及经验

转染步骤及经验
1.根据要进行体细胞转染的实验的特殊要求，选择适当的载体质粒，以及目标细胞。

2.制备转染的DNA样本：根据质粒的大小和实验的要求，严格控制样本的DNA浓度，并确保其质量良好，无杂质；
3.准备转染液：将转染的DNA样本和必要的添加剂放入适量的
PBS/DMEM中混合，形成转染液；
4.细胞放入转染液中：把细胞放入适量转染液中，使细胞与转染液充分混合；
5.细胞转染：细胞转染的方法有优化的转染技术（如脉冲转染）和非优化转染技术（如胞浆转染），根据实验对转染效果的要求，选择合适的转染技术；
6.细胞休眠：细胞休眠后，为后续实验提供了理想的条件，简化接下来的操作。

7.细胞筛选：有些载体质粒将特定的标记物（如GFP）植入细胞内，接着，使用不同颜色的染料或者发光技术，筛选出转染后的细胞，这将有助于后续的实验。

8.检测转染效率：使用细胞膜染色，PCR，蛋白表达分析来检测转染效率，以证实转染是否成功。

9.细胞接种：转染细胞分离后，接种到HMVEC或其他细胞上，以复制体系，以便进一步的研究。

细胞转染是一个复杂的过程，需要仔细地操作。

转染步骤及经验

转染步骤及经验转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。

本文将介绍转染的步骤及经验，并提供一些实用的技巧，旨在帮助读者顺利完成转染实验。

一、实验准备在进行转染实验前，必须做好充分的实验准备工作。

以下是一些关键准备步骤：1.1 细胞培养与处理- 培养适量的目标细胞，并确保其良好的生长状态。

- 处理细胞，使其处于适宜转染的状态。

例如，对于贴壁细胞，可以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。

1.2 载体准备- 准备带有目标基因的载体。

这可以是质粒、病毒等。

- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。

1.3 转染试剂- 准备合适的转染试剂，如转染剂、离子可溶液等。

不同类型的细胞需要使用不同的试剂。

二、转染步骤转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。

以下是一般的转染步骤：2.1 细胞处理- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。

- 注意不要创建过高的转染细胞密度，以免影响转染效率。

2.2 与载体混合- 将载体与转染试剂混合，形成载体-试剂复合物。

根据实验需要可做不同浓度的复合物。

- 注意操作过程中避免产生气泡，以防止对细胞的损伤。

2.3 加入转染复合物- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中，确保复合物均匀分布在细胞表面。

- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。

2.4 培养细胞- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。

- 在培养期间，根据实验设计进行后续处理，如观察表型、提取蛋白等。

三、经验分享3.1 优化试剂浓度- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同，需要根据实验经验进行优化。

试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。

3.2 选择合适的转染方法- 根据研究目的和所用试剂的特性，选择合适的转染方法。

常见的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。

3.3 控制转染时间和温度- 不同细胞对转染复合物的吸收速度有差异，应该根据细胞类型和试剂特性确定合适的转染时间和温度。

细胞转染技术从入门到精通

细胞转染技术从入门到精通概念：概括地说，转染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）进入细胞的过程。

转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。

转染的类型根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。

根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。

瞬转：因为导入的核酸没有整合到宿主细胞基因组，因此它只会短暂地存在于宿主细胞中，不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。

然而，导入的遗传物质的高拷贝数导致其在细胞内的蛋白质表达水平较高。

根据所使用的载体的不同，瞬转通常可以1至7天内进行基因检测，但是瞬时转染的细胞通常在转染后24-96小时收获。

当使用超螺旋质粒DNA时，瞬时转染的效果最好，推测是由于超螺旋质粒DNA能更有效地被细胞摄取。

稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。

与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。

然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。

由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。

其中比较可靠地筛选方法是在DNA载体中包含选择性标记，然后在细胞转染短暂性恢复后进行适当地选择性加压。

尽管相对于超螺旋DNA，线性DNA被细胞摄取的效率较低，但其能最有效地整合到宿主基因组中。

目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。

但表达mg/L-g/L 的重组蛋白主要依赖于稳定细胞系的产生。

瞬转和稳转的比较瞬转稳转导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上导入的DNA整合到基因组中导入的遗传物质不传递到子代；遗传改变只是暂时的导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的不需要选择性筛选需要选择性筛选出稳定转染的细胞DNA载体和RNA都可用于瞬时转染只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。