色层分离法全解

大网格吸附剂
聚酰胺等 应用于亲水性发酵
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2.3 亲和层析


2.3.1亲和作用的本质 具有亲和作用的分子（物质）对之间具有“钥 匙”和“锁孔”的关系，这是必要条件。除此 以外，还需要分子或原子水平的各种相互作用， 才能完整地体现亲和结合作用。 a. 静电作用 b. 氢键 c. 疏水性相互作用 d. 配位键 e. 弱的共价键
紫外吸收

柱层析分离法的有关装置
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4、色层分离法介绍
吸附色层分离法
基于溶质分子与固定相作用的 机理不同；利用吸附剂对组分的吸附能力的差别进 行分离
Fra Baidu bibliotek
用来填充柱的物质包括无机吸附剂和有机吸附剂。
无机吸附剂 磷酸钙 二氧化钛 氢氧化锌 氧化铝凝胶 澎润土
等；静电相互作用 特异结合位点
有机吸附剂
产物的分离
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2.3.3.1 亲和配基



e. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶的辅酶——NAD、NADP 激酶的辅酶——ATP AMP、ADP与上述辅酶的结构类似。 f. 三嗪类色素 三嗪类色素是一类分子内含有三嗪环的合成活 性燃料，与各种需要在 NAD 的存在下表现其生 物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用，还与血 清白蛋白、干扰素、核酸酶、糖解酶等具有很 高的亲和力。
固定相 固体或是包埋在惰性固体里的液体 移动相 气体 (GC) 或液体 (LC) 需要离析的样品
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甘氨酸
组氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
纸层析法是分离鉴定蛋白
质的氨基酸组成的重要工 具。
纸层析小实验动画演示
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层析柱
混合泵 蠕动泵 磁力搅拌器
分光光度计
酶试剂 紫外检测器
P-5
酶活性 双笔记录仪 部分收集器
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原理
流动相石油醚 固定相 CaCO3
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分离介质
足够的亲水性，保证有较高的收率 足够大的多孔性，使大分子能透过 有足够强的刚度，可在大生产中使用 良好的化学稳定性 能引入各种功能团
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2.2 基本概念及其分类
色层分离是基于当含有被分离物质的料液 渗滤通过有吸附剂离子涂铺的层(薄层层析) 或填充的管子(柱层析)时，对混合物各组分 产生选择性的阻滞作用。
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2.3亲和层析

利用生物体内存在的特异性相互作用的分 子对而设计的层析方法。
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2.3.2 原理与操作

亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附 介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标 产物得到分离纯化的液相分离法。
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2.3.3 亲和吸附介质

2.3.3.1 亲和配基 a. 酶或酶的抑制剂 b. 抗体或抗原 c. A蛋白：A蛋白与IgG有很强的亲和作用。A蛋 白存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中。 d. 凝集素（lectin） 凝集素是与糖特异结合的蛋白质的总称。不同 的凝集素与糖结合的特异性不同。如：ConA与 葡萄糖和甘露糖的结合作用较强；麦芽凝集素 与N-乙酰葡糖胺的亲和作用较强。
填充CaCO3的玻璃柱管叫做色谱柱 具有大表面积的 CaCO3 固体颗粒称为固定 相(stationary phase) 推动被分离的组分(色素)流过固定相的惰性 流体 ( 上述实验用的是石油醚 ) 称为流动相 （mobile phase） 在柱中出现的有颜色的色带叫做色谱图 （chromatogram）。
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2.3.2.2 载体简介
1）多孔玻璃载体 玻璃对酸碱、有机溶剂及生物侵蚀非常稳 定，并且本身又特别坚硬，易于化学键合 安装分子臂，是一极为理想的载体。 但由于目前价格昂贵，而且有时呈现 SiOH 基的非特异性吸附，这是最大的缺 点。由于其应用上极大优点，克服缺点方 面的研究正在进行中。

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2.3.2.2 载体简介
2）聚丙烯酰胺凝胶载体 丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的共聚物是一良好载 体。具有三向网状结构和碳氢骨架，而它的大量酰胺基 支链非但使凝胶具有亲水性，且可供活化。其缺点是在 配基偶联后网块缩小不利于亲和层析。 3）纤维素载体 纤维素是其中最经济的一种可作为固相载体的物质。 但纤维素作为亲和层析载体尚有许多缺点： ①活化后会产生带电荷的离子； ②物理结构紧密，蛋白和核酸的通透性则受空间位阻所 阻碍。

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2.3.2.2 载体简介
4）葡聚糖凝胶载体 葡聚糖凝胶商品名Sephadex，是用环氧氯丙烷 作为交联剂，把多聚葡萄糖交联而成的珠状凝 胶。其化学性能及物理稳定性都较好，但多孔 性能较差。最松散的结构是Sephadex G-200， 也只能让分子量6×105的球蛋白通过。 葡聚糖凝胶只适合与小配基制成亲水吸附剂以 及免疫吸附系统，由于用在这方面容量和通透 性的要求都不高，一般较常用。

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色谱法（chromatography）
色谱分析法实质上是一种物理化学分离方法，
即利用不同物质在两相(固定相和流动相)中具有 不同的分配系数(或吸附系数)，当两相作相对运 动时，这些物质在两相中反复多次分配(即组分 在两相之间进行反复多次的吸附、脱附或溶解、 挥发过程)从而使各物质得到完全分离。
固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体； 流动相，液体或气体。

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创建 2. 色层分离法的产生和发展

石 油 醚
1903 年 俄国植物学家 Tsweet茨维特 植物提取液 CaCO3玻璃柱 石油醚淋洗

色 ：颜色 色
谱 谱 ：图谱
1906年茨维特 论文发表
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色谱法（chromatography）
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2.3.3.1 亲和配基
g. 过渡金属离子 h. 肝素 肝素与脂蛋白、脂肪酶、抗凝血酶、凝 血酶、FGF等蛋白质具有亲和作用

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2.3.2 载体



将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面即可制 备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的 载体。 2.3.2.1. 对载体的要求 1）非专一吸附要小、高度亲水、惰性。 2）具有大量可供活化和配基结合的化学基团。 有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 3）有较好的化学稳定性和对酶及微生物侵蚀稳 定，有良好的机械性能，颗粒均匀。
12 色层分离法
Chromatography
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主要内容
1概述 2色层分离法的产生和发展(基本概念及色 谱展开技术) 3色层分离的有关术语 4各类不同分离机制的色层分离法介绍 5色层分离过程理论 6层析的放大

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1. 概述

色层分离，又叫色谱法、层离法、层析法等。
色谱法是利用不同溶质（样品）与固定相和流动相 之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别， 当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平 衡，使各溶质达到相互分离。