色层分离法-课件

(5). 显色
展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂 前沿作记号 a. 有色物：直接观察各个色斑 b. 无色物： 物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发 出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑 点的位置及大小。
化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒 适当的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷 酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸 确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷 茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。 其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。 (6). 分析
Al2O3 －HF254 氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指
Al2O3 －GF254 氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示
剂（在254 nm下呈黄绿色荧光）
上述商品可以直接调料涂敷（1份料，2份水调合）
(2). 硅胶
OH HO Si OH
硅胶的结构为:
OH ( O Si OH )n O OH Si OH OH
色层分离法
概述

石 油 醚
历史
1906年俄国植物学家Michael Tswett首次发现
色谱法 层析法 层离法
色层分离的基本原理

色层系统组成
固定相
固定不动的物质称作固定相(固体或液体)
流动相
推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体
按流动相分类
色谱分离法
气相色谱
液相色谱
气－液 气液色层分离法
样2 ~ 20 μl于滤纸上，以冷风吹干； d. 干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于 层析缸中展开。
(4).展开
A. 展开剂
展开剂的选择：
欲分离物在两相中的溶解度；
展开剂的极性
展开剂与欲分离物间应无化学反应
欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温 度的影响 欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到
a. 上行法
将点有试样的滤纸条的 下端浸入溶剂（但不能浸没 点样处）上端固定在层析缸 的上部，保持垂直，将缸密 闭，使溶剂沿下端上升而展 层。待溶液上升到距离纸上
端3 ~ 4 cm 时，将滤纸取出，
用铅笔在溶剂前沿处画线作
记号（见右图）
对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法 a. 纸条的上端暴露在 层析缸外，以便令 上升的溶剂挥发； b. 只要保持纸条下端 与溶剂面接触，溶 剂便能不断地上升 而挥发，展层过程 就自动连续地进行；
一般要求薄板用的活性为Ⅱ ~ Ⅲ级 氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量 的水份时，吸附剂表面的吸附中心回被水分子 占据）
活性
Ⅰ
Ⅱ ３
Ⅲ ６
Ⅳ １０
Ⅴ １５
含水量（％）０
故加热驱除水－活化；加入一定量的水－失活 Δ 100 ~ 150oC, 除去Al2O3中与羟基结合的部分水 份，使Al2O3有一定的活性
比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相
同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜
色、面积进行比较，确定其可能的含量。
反射散射光谱法：
(7). 应用
例１．氨基酸的分离（固定相为水）
流动相 分离情况
正丁醇：2 mol/L HAc = 酪氨酸、二碘酪氨酸 1 : 1 用水饱和的苄醇 亮氨酸、异亮氨酸
气－固 气固色层分离法
液－液 液液色层分离法
液－固 液固色层分离法
色层分离的基本原理
利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各 组分在两相中的分布程度不同，从而使各组 分以不同的速度移动而达到分离的目的。
吸附力 分子形状及大小 分子亲和力 分配系数
性 质
色层分离法基本原理
层析分离分类

按溶质分子与固定相相互作用机理
样量只需g或ng；若进行天然物或中间产物的分
离时，点样量需50 g~几百微克；若进行制备色谱， 进样量可达1mg。点样时可用内径约1mm，管口平
整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，
分数次滴加样品。
注意点：
a.溶解试样的溶剂最好是挥发性的
b.点样宜分几次点加,即点一次后, 用吹风机的冷风
Rf的计算
y x
Rf的大小取决于溶质在二相间的分配系数 及滤纸的性质. 不同的组分具有不同的分
配系数, 因而也就有不同的Rf. 这就是定
性的依据. 3. 影响Rf的因素 (1). 欲分离物的本性:物质在两相的分配系 数,决定了它的Rf大小;
(2). 层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。
通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值>0.05.
b. 要求滤纸的纤维松紧适宜
c. 滤纸的杂质含量少
固定相 纸层析－以吸着在纤维素上的水作固定相。 反相纸层析－用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙 二醇等作固定相。 若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油 作固定相。
(2). 试样 A.试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙 酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂 。液体样，直接点样。
Δ150 ~ 300oC， Al2O3活性达Ⅱ～ Ⅲ级
Δ300 ~ 400oC，Al2O3活性达Ⅰ ～ Ⅱ 级
Δ >600oC， Al2O3进一步脱水并开始烧结
由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，
每批生产的Al2O3 ，其表面积和表面孔穴结构并
不一致，活性也不相同。
市售的供薄层色谱用的Al2O3有: Al2O3 －H 氧化铝中无粘合剂 Al2O3 －G 氧化铝中含煅石膏（一般5％煅石膏） ［煅石膏CaSO4，作为粘合剂］ 示剂（在254 nm下呈黄绿色荧光）
a. 定性：［实验条件］，各物质有各物质的Rf。 为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下 与已知的纯物质做对照实验
Rf 的计算:
y x
Rf = x / y
b. 定量 剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然 发射光谱），也可将斑点剪下灰化，再用适当
后用各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、 的溶剂溶解，测之。
c.
若溶剂沸点＞100oC，则可在纸条暴露部分 用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；
d. 该法不能测量前沿，但可达分离的目的。
b. 下行法
溶剂自纸的上端向下降（借助于重力的作用）， 具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。
4. 操作技术 (1). 滤纸(担体)滤纸的选择 a. 要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐
纸色层
微量操作技术，简、分离效率高、但 分离速度慢
１、基本原理 纸色层－纸上萃取色谱，它和萃取一样，
它也是根据不同物质在两相间的分配比不同而
进行分离的（相当于逆流萃取）。
1.层析缸
1 2 6 5
2.滤纸 3.原点
7 3 4 3
4.展开剂
5.前沿 6.7.斑点
2. 比移值Rf 组份分离后,它们在滤纸上的 位置用比移值Rf表示. [定义]:
(3). pH:影响它们的存在状态
(4). 滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机
械强度、不含杂质
(5). 温度:在层析缸中用红外灯照射。温度 会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。 层析操作应在恒温下进行，温度不超过± 0.5oC (6). 展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下 行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的 Rf也不大。
叔丁醇：甲乙酮：甲酸： 亮氨酸、异亮氨酸 水＝16 : 16 : 0.1 : 3.9
流动相
分离情况
２－丁醇：醋酸：水＝ 甲状腺素、二碘酪氨酸 32 : 2 :22
流动相１：丁醇： HAc :H2O = 4 : 1 :5 流动相２：M－甲酚－ 酚：pH = 9.33硼酸缓 冲液 = 1 : 1
亮氨酸、异亮氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸、缬氨酸、 甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨 酸、脯氨酸、谷氨酸、苏 氨酸、门冬氨酸、谷氨酰 酸、门冬酰氨、精氨酸、 组氨酸、赖氨酸、胱氨酸 等
(2)点样 适当的点样量，集中的斑点是得到一个好 的色谱的必要条件。如何才适当？不同的分离 要求、不同的薄板（有厚有薄）、不同的吸附 剂（性能不一），需要不同的点样量。从下图
可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，
易拖尾或扩散，影响分离效果。
Rf 0.5
0.3
0.1
0.1
2
50
300
g
纯物质的鉴定，若又有高灵敏度的显色剂，点
酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸
4. 操作技术 （1）制板
•玻璃板 a .平整、去油、去污（可用浓H2SO4K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后， 烘干）b. 玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选
择，小的可用2.57.5cm的载玻片,
20 20cm的玻片。
大的可用
•涂布液 取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的 水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，
当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，
立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。
•涂布方法
玻棒涂布：
玻片刮涂 倾斜涂布（利用流平性）-简，但均匀性差 涂布器
•活化 薄板首先风干，否则湿板一下加热到高温， 烘出的薄板很酥松，使用效果不好。 氧化铝G板在150 ~ 160oC, 烘4小时(Ⅱ级左右) 硅胶G板在110oC烘1小时 薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器 或烘箱中备用。
薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）、
硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧
光物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光
剂） 此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺 、纤维素也可用作吸附剂。
来自百度文库
３．展开剂（流动相）
展开剂的洗脱作用实质是展开剂分子与欲分离 组分竟争占据表面吸附中心的过程。 强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强， 所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据 吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脱作用。 （1）常用展开剂的极性： 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙 烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙
①吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力） ②分配层析（溶质在两液相间分配系数不同） ③凝胶过滤（分子大小与形状） ④亲和层析
层析分离分类

按操作形式不同分类：
①柱层析： ②纸层析： ③薄层层析：
柱色谱：在一根玻璃管或金属管中迸行的色谱技术 纸色层：滤纸吸附的水作固定相，有机溶剂作流 动相。 薄层色谱：把吸附剂粉末舖成薄层作为固定相。
[克服办法］：标样和试样在同一块板上展开
2. 吸附剂（固定相） 决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、 活性、表面积 ［要求］： •合适的吸附力
•与展开剂、被吸附物质均不起化学反应
•粒度细小而且均匀（范氏方程，减少涡流扩
散项）
(1). 氧化铝 氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物 在氧化铝上吸附的很牢（所以，酸性物质分离 不好），故通常用于分离碳氢化合物、生物碱 类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物 质。
把点好样品的薄板浸入0.5cm 深的适宜展开剂中，当展开 剂移动至离起点约10 ~ 20cm
处(约30min)，将薄板取出放
平，用铅笔或小针记下溶剂 前沿的位置后，在室温干燥 或烘箱内干燥，测其Rf值。
注意：每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复
（４）检出
a.本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜 色 b.本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色 的荧光 c.薄板本身有荧光（硅胶HF254+366, 硅胶GF254, ......), 欲测物吸收紫外线, 在荧光背景下呈暗色
吹干, 再点, 再吹干, ......., 反复,直到点完所要求 的量 c. 点样量的体积尽可能小些(2 ~ 10L左右) d. 点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环境下 完成, 避免薄板吸水降低活性.
溶剂前沿
15cm 1.5cm 2.5cm
（３）展层 薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容 器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析相 同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平 面成20 ~ 10oC角）的上行或下行的展层而不能垂 直展层。
第二部分、薄层色谱法
1. 原理和特点
[原理]: 当展开剂从薄板上固定相的空隙中通过 时, 由于各组分的K的不同和足够多次的分配. [特点]: •装置简、操作方便 •展开时间短 •样品负荷量大、斑点扩散少
•同一张色谱图可用不同的试剂显斑，也可
用浓硫酸等强氧化剂或在400 ~ 500ｏＣ 加
热碳化检出 [缺点］：Rf值的重复性差
(3).点样方法 a先用铅笔在距纸条一端2 ~ 3 cm处划一条直线（ 起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点 样位置；见下示意图：
b.点样工具：微量注射器、毛细滴管（Φ＝0.5 mm) ； c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号
接触，使点样的斑点直径为0.2 ~ 0.5 cm, 每次点