核酸杂交技术
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• 在5’端的磷酸基团上也可进行化学修饰。
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核酸探针的种类
• 根据标记方法不同可粗分为放射性探 针和非放射性探针两大类；
• 根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA探针，RNA探针，cDNA探针， cRNA探针及寡核苷酸探针等几类；
• 固相杂交： Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交 方法，称为DNA-琼脂技术。
• 膜杂交：60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或 RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列 奠定了基础。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基 因的拷贝数。
• 原位杂交：Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次 用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位。
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核酸分子杂交的发展
• 液相杂交：Hall等1961年将探针与靶序列在溶液中杂交， 通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不 精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。
cDNA探针
• cDNA （ complementary DNA ） 是 指 互 补 于 mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶 （reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化产 生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致 癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据 碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA （其中U与A配对）。这一途径与一般遗传信息流 的方向相反，故称反向转录或逆转录。
• 这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列） 和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又 称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于 检测mRNA的表达水平。
• 因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要 比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可 用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途， 在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录 状况。
• 非同位素性标记探针：多家公司推出多种非放射性 探针标记试剂盒。分类：金属如Hg，荧光物质如 FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过 氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶 （AKP）等。
• 不同的标记物，标记方法及检测方法也各异。
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核酸杂交
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• 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完 全互补。
• 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA 与DNA的二条单链之间进行。
• DNA与DNA杂交：一般DNA以双链存在，在进行 杂交时，先将其解聚成为单链（变性）。再退火 使单链聚合成双链。
• 定性或定量分析分子杂交：将一种核酸单链用同 位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸 单链进行分子杂交。
目的与要求
A. 了解核酸探针的概念、种类及选择原则 B. 了解核酸探针的标记和检测方法 C. 了解常用核酸杂交的方法及应用
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核酸分子杂交
• 核酸分子杂交的基础：分子单链之间的互补碱基 通过非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定 的双链区。
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克隆探针的特点
• 前述三种探针均是可克隆的，其优点：在DNA序 列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序 时，因为克隆探针较寡核苷酸探针特异性强，较 长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少； 可获得较强的杂交信号
核酸探针的标记和检测
• 放射性同位素标记探针：常用的放射性同位素有 32P和35S ，前者能量高，信号强，最常用。此种探 针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制 （32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I 的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年， 但 它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能 用于组织原位杂交。
探针
• 探针：带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特 异靶分子结合。
• 核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不 同，通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结 合。
• 核苷酸经某一原子、功能基团或侧链修饰后仍可能 进行碱基配对。能与核酸结合的单一原子有银、溴 和碘等。
• 放射性同位素32P和35S标记核酸时，是掺入核酸骨架 的磷酸二脂键中，因此碱基未发生任何修饰。
② 寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化， 因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体 的Tm值。
③ 一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg）， 使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核 苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放 射性标记物的标记。
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核酸探针的常用标记技术
1．缺口平移：该技术由Kelly等于1970年创立。 • 原理：先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链
上制造一些缺口（nick）, 再在大肠杆菌DNA聚 合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上； 利用大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外 切酶活性，将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果 即缺口平移（nick translation）；用高强度的 放射性核苷酸（通常为α-32PdNTP） 置换先前存 在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每 分钟计数）/μg的32P标记DNA。 • 用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交 要求。
DNA探针的优点
• ①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无 限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• ②DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方 法可供选择，如缺口平移，随机引物法， PCR标记法等，能用于同位素和非同位素 标记
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• 制备方法：RT-PCR
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RNA探针
• RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由 于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂 交反应效率极高。早期采用的RNA探针是 细 胞 mRNA 探 针 和 病 毒 RNA 探 针 ， 这 些 RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率往往不高，且受到 多种因素的制约。这类RNA探针主要用于 研究目的，而不是用于检测。
• DNA探针还有单链和双链之分。
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DNA 探针
• DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或 单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有 细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA 探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列。 这些DNA片段须是特异的。
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反义RNA探针
• 通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA 聚 合 酶 ， 可 以 控 制 RNA 的 转 录 方 向 ， 即 以 哪 条 DNA链以模板转录RNA。
• ，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克 隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选， 最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌 的特异性基因片段
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–洗膜条件：在进行点突变检测杂交的反应时， 洗膜条件和温度选择往往更为重要。所选漂洗 条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交 信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可 以通过逐渐提高洗膜温度来完成。
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应用寡核苷酸针的原则
①长18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低； 较短探针特异性会差些。
②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围 则会增加非特异杂交。
③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探 针杂交的“发夹”状结构。
④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如CCCCC-。
⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与 核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列 的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过 70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则， 该探针不能用。
Whats the matter Mikecan you play the guitarwhat time do you go to sc探针：特异性高、低本底
• 进行探针合成与标记：高灵敏度、低本底
• 摸索合适的杂交条件
–杂交温度：方法是制备几张点有特异靶DNA和 不相关DNA的膜，各膜分别在不同温度下与探 针杂交，特异靶DNA杂交信号强而非特异DNA 不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。
合成的寡核苷酸探针的优点
① 由于链短，其序列复杂度低，所以和等量靶位点 完全杂交的时间比克隆探针短，如20nt的寡核 苷 酸 探 针 在 浓 度 为 100ng/ml ， 靶 序 列 为 1 ～ 100pg 、 1kb 片 段 或 3×10-18~3×10-16mol/L 时，达到最大程度的杂交只需10min，而用2kb 的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h。
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核酸分子杂交的技术要素
• 核酸探针的制备 • 核酸探针的标记 • 核酸标记探针的检测 • 核酸分子杂交的技术方法
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• 缺点：较长的探针对于靶序列变异的识别能力又 有所降低，如对于仅是单个碱基或少数碱基不同 的两序列，克隆探针不能区分 ，往往杂交信号相 当；这既是其优点，又是其缺点：优点是当用于 检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少 许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。
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核酸探针的种类
• 根据标记方法不同可粗分为放射性探 针和非放射性探针两大类；
• 根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA探针，RNA探针，cDNA探针， cRNA探针及寡核苷酸探针等几类；
• 固相杂交： Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交 方法，称为DNA-琼脂技术。
• 膜杂交：60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或 RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列 奠定了基础。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基 因的拷贝数。
• 原位杂交：Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒 cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次 用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位。
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核酸分子杂交的发展
• 液相杂交：Hall等1961年将探针与靶序列在溶液中杂交， 通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不 精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。
cDNA探针
• cDNA （ complementary DNA ） 是 指 互 补 于 mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶 （reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化产 生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致 癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据 碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA （其中U与A配对）。这一途径与一般遗传信息流 的方向相反，故称反向转录或逆转录。
• 这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列） 和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又 称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于 检测mRNA的表达水平。
• 因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要 比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可 用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途， 在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录 状况。
• 非同位素性标记探针：多家公司推出多种非放射性 探针标记试剂盒。分类：金属如Hg，荧光物质如 FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过 氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶 （AKP）等。
• 不同的标记物，标记方法及检测方法也各异。
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核酸杂交
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• 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完 全互补。
• 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA 与DNA的二条单链之间进行。
• DNA与DNA杂交：一般DNA以双链存在，在进行 杂交时，先将其解聚成为单链（变性）。再退火 使单链聚合成双链。
• 定性或定量分析分子杂交：将一种核酸单链用同 位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸 单链进行分子杂交。
目的与要求
A. 了解核酸探针的概念、种类及选择原则 B. 了解核酸探针的标记和检测方法 C. 了解常用核酸杂交的方法及应用
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核酸分子杂交
• 核酸分子杂交的基础：分子单链之间的互补碱基 通过非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定 的双链区。
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克隆探针的特点
• 前述三种探针均是可克隆的，其优点：在DNA序 列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序 时，因为克隆探针较寡核苷酸探针特异性强，较 长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少； 可获得较强的杂交信号
核酸探针的标记和检测
• 放射性同位素标记探针：常用的放射性同位素有 32P和35S ，前者能量高，信号强，最常用。此种探 针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制 （32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I 的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年， 但 它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能 用于组织原位杂交。
探针
• 探针：带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特 异靶分子结合。
• 核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不 同，通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结 合。
• 核苷酸经某一原子、功能基团或侧链修饰后仍可能 进行碱基配对。能与核酸结合的单一原子有银、溴 和碘等。
• 放射性同位素32P和35S标记核酸时，是掺入核酸骨架 的磷酸二脂键中，因此碱基未发生任何修饰。
② 寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化， 因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体 的Tm值。
③ 一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg）， 使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核 苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放 射性标记物的标记。
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核酸探针的常用标记技术
1．缺口平移：该技术由Kelly等于1970年创立。 • 原理：先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链
上制造一些缺口（nick）, 再在大肠杆菌DNA聚 合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上； 利用大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外 切酶活性，将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果 即缺口平移（nick translation）；用高强度的 放射性核苷酸（通常为α-32PdNTP） 置换先前存 在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每 分钟计数）/μg的32P标记DNA。 • 用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交 要求。
DNA探针的优点
• ①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无 限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• ②DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方 法可供选择，如缺口平移，随机引物法， PCR标记法等，能用于同位素和非同位素 标记
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• 制备方法：RT-PCR
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RNA探针
• RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由 于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂 交反应效率极高。早期采用的RNA探针是 细 胞 mRNA 探 针 和 病 毒 RNA 探 针 ， 这 些 RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率往往不高，且受到 多种因素的制约。这类RNA探针主要用于 研究目的，而不是用于检测。
• DNA探针还有单链和双链之分。
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• ，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克 隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选， 最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌 的特异性基因片段
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–洗膜条件：在进行点突变检测杂交的反应时， 洗膜条件和温度选择往往更为重要。所选漂洗 条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交 信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可 以通过逐渐提高洗膜温度来完成。
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①长18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低； 较短探针特异性会差些。
②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围 则会增加非特异杂交。
③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探 针杂交的“发夹”状结构。
④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如CCCCC-。
⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与 核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列 的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过 70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则， 该探针不能用。
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• 进行探针合成与标记：高灵敏度、低本底
• 摸索合适的杂交条件
–杂交温度：方法是制备几张点有特异靶DNA和 不相关DNA的膜，各膜分别在不同温度下与探 针杂交，特异靶DNA杂交信号强而非特异DNA 不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。
合成的寡核苷酸探针的优点
① 由于链短，其序列复杂度低，所以和等量靶位点 完全杂交的时间比克隆探针短，如20nt的寡核 苷 酸 探 针 在 浓 度 为 100ng/ml ， 靶 序 列 为 1 ～ 100pg 、 1kb 片 段 或 3×10-18~3×10-16mol/L 时，达到最大程度的杂交只需10min，而用2kb 的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h。
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核酸分子杂交的技术要素
• 核酸探针的制备 • 核酸探针的标记 • 核酸标记探针的检测 • 核酸分子杂交的技术方法
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• 缺点：较长的探针对于靶序列变异的识别能力又 有所降低，如对于仅是单个碱基或少数碱基不同 的两序列，克隆探针不能区分 ，往往杂交信号相 当；这既是其优点，又是其缺点：优点是当用于 检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少 许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。
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