冷冻保藏菌种
冷冻干燥保藏法
（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。
（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。
（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。
（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa （0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。
菌液的制备及保存讲课教案
菌液的制备及保存
精品文档 1目的 菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。规范菌种原始菌液的制备及长期保存。 2内容 2.1定义 原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。 工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。 2.2 总则 微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。 经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。 生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。 原始菌种的传代次数最多传至第五代。 2.3 培养基 2.4 冻干菌制备原始菌液 2.4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液 2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。 2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化； 2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中； 2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间； 2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。 2.4.2 由集菌平板制备原始菌液 2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。不同培养基适用于不同菌种。 2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。 2.4.2.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
菌种活化保存法
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
菌种保存方法
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
菌株保藏方法介绍
菌种保存方法 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。
菌种保藏的主要方法
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法
菌种保存大家谈。甘油的浓度。Word版
菌种保存大家谈。甘油的浓度。 2009-08-15 01:13 大家好！ 我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！ 因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？ 望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！ 作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55 有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项? 甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？ 作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34 冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。 由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。不适合酷友频繁的求助菌种。我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。-20摄氏度保存即可。我们的菌种有保存七八年的依然能用。方便快捷。管理员不妨试试。 作者: 保藏中心时间: 09-2-20 23:03 :'终于有酷友理我了！感动ing 十分感谢您的指教！为了表达谢意，加两点威望
怎样进行一个菌种的保藏
一、怎样进行一个菌种的保藏、扩繁以及防止退化措施 （一）菌种的保藏 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 1、传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 1.1斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 1.2穿刺培养 用接种针拉直了挑菌直接穿到培养基的底层培养，用于厌氧性或兼性厌氧性细菌的培养。 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法
实验12-微生物菌种常用简易保藏法
实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
甘油冷冻保藏法
甘油冷冻保藏法 本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。 （1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。 （2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。 （3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。 （4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。 （5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。 冷冻干燥保藏法 （1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，备用。 （2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。 （3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。 （4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。 将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。 （5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。 抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。 （6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。 滤纸保藏法 （1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。 （2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。 （3）取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。 （4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。 （5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
国内外菌种保藏机构名称与缩写
国内外菌种保藏机构名称与缩写 国际保藏单位名单（截至2009年8月） 国外主要菌种保藏机构： 1.澳大利亚NMI 2.比利时BCCM(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms) 3.保加利亚NBIMCC(National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures) 4.加拿大NMLHC(National Microbiology Laboratory) 中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC):
CCTCC保藏的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、转 基因细胞、杂交瘤、原生动物，地衣，植物组织培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质 粒和基因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。 普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC的宗旨是广泛收集国内外的微生物资源，妥善保存，以公开的保藏机构的名义为工农 业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供标准化的实验材料,在保证生物安全和保护知 识产权的前提下，为第三者能够自由地利用各种微生物材料提供服务，最大限度的实现微生 物资源的保护、共享和持续利用。 7.捷克CCM(Czech Collection of Microorganisms) 8.法国CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) 9 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种 保藏中心 DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、 抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。该中心是欧洲规模最大的 生物资源中心，保藏有细菌9400株，真菌2400株，酵母500株，质粒300株，动物细胞 500株，植物细胞500株，植物病毒600株，细菌病毒90株等。该中心保藏的菌种可出售。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。 10.匈牙利NCAIM(National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms) 11.意大利ABC(Advanced Biotechnology Center) 12.意大利DBVPG(Dipartimento di Biologia Vegetale, Perugia) 13.拉托维亚MSCL(Microbial Strain Collection of Latvia) 14 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心
菌液的制备及保存
1目的 菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。规范菌种原始菌液的制备及长期保存。 2内容 2.1定义 原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。 工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。 2.2 总则 微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。 经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。 生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。 原始菌种的传代次数最多传至第五代。 2.3 培养基 2.4 冻干菌制备原始菌液 2.4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液 2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。 2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化； 2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中； 2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间； 2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。 2.4.2 由集菌平板制备原始菌液 2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。不同培养基适用于不同菌种。 2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。 2.4.2.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
菌种保存方法-
菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
菌种保存方法
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
菌种保藏和复苏-精简版
菌种的保藏与复苏 一、菌种保藏 （一）菌种保藏的定义 菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。 （二）菌种保藏的原理 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。 （三）菌种保藏的方法 本实验室常用菌种保藏方法主要有： 1.低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。 平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。 此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。 2.甘油冷冻管保藏法 菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有
常用菌种保藏方法
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 素而设计的。 一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法 菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。 一、菌种保藏基本原理 通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。 二、菌种保藏的方法 试管斜面菌种系列保存方法 1低温定期移植保藏法 将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。 2液体石蜡保藏法
取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。 3白胶塞封口保存法 选择与试管口径相符的白胶塞，用%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。 4蒸馏水保藏法 将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。 非斜面固体菌种系列保存法 1麦麸保藏法 将麦麸和水按∶1充分拌匀后，装入试管高压灭菌，经无菌检查合格后接种，适温下培养至菌丝体发育好后，将试管放入真空干燥器内，用真空泵将麦麸培养基内水分抽干，然后移入盛有硅胶的干燥器内，用凡士林密封在常温下保存，可保藏3～5年。
菌种保藏中心名称
菌种保藏中心名称 简介 ATCC (American Type Culture Collection ） 美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免 疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏 方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研 究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865 株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center) 日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC （IFO ）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农 业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研 究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保 藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 NRRL 是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微 生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。 该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株， 酵母14500株，放线菌9500株。 另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定 服务。 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 CBS 是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。 该中心主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。 该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。该中心保藏的菌种可出售。
甘油管冷冻保藏方法收集-2
§菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。 方法： ①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅 15min消毒，放烤箱80℃烤干。 ②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。 ③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。 ④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。 §该改良法优点有： ⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。 ⑵菌种管抗破损性极佳； ⑶菌种管体积超小。⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。 笔者使用该改良法近七年，本省发放菌种上万只没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情况良好。近几年我们还向华东地区部分兄弟省分提供了室间质评菌种四万余只，效果满意。 实验——微生物菌种常规保藏方法 录入时间:2011-4-13 9:30:37 来源：天津农学院精品课程 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、
不衰、不变，以便于研究与应用。 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏 5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签