菌种的保藏和培养(第一讲).
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保存管内，密封，在乙醇－干冰或液氮中冻结
后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌
接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏 附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB 琼脂平板表面，于37度过夜。
2、细菌甘油保存（2）：
在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板
表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，
遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
2、菌种的复壮：
纯使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过
纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中
找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状 的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意 识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，
的保藏
3、载体保藏
保藏方法：是将微生物吸附在适当的载体，如 土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的
保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相
当广泛。 保藏期限：一般为1～10年。 注意事项：以沙土保存和滤约保存为主。
4、沙土管保藏法
保藏方法：制备沙土管斜面培养菌悬液 移入沙土管干燥后熔封低温保藏 保藏期限：因菌种而异，一般可达10年以上
国内外菌种保藏机构：
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌
种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不
衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)
美国的典型菌种保藏中心(ATCC)
英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
三、保藏方法
以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发
突变（正变）不断地从生产中选种
四、菌种的退化与复壮
3、控制衰退的措施：
控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不同类型的细胞进行接种传代 采用有效的菌种保藏方法
4、菌种复壮的措施：
纯种分离 通过寄主进行复壮 淘汰已衰退的个体
五、 接种、分离纯化与培养
接种方法
1. 斜面接种（基础，无菌操作）
2. 液体接种（固液、液液、液固）
3. 穿刺接种（半固体培养基） 4. 点植接种（霉菌菌落形态观察） 5. 平板划线接种（最常用） 6. 平板倾注接种（混合生长，稀释度是关键）
7. 平板涂布接种（表面生长，稀释度是关键）
8. 活体接种（限于病毒或部分病原微生物）
再ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，
振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存
管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方
法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的 cDNA文库。
四、菌种的退化与复壮
1、菌种的退化： 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的
存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、
注意事项：方法简单，保藏时间较长，复活方
便；适用于保藏耐干燥的芽孢或孢子，对干燥
敏感的细菌不宜采用
5、普通冷冻保藏法
保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种 加入菌种保护剂，密封于试管或 EP 管内，贮藏
于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中
保藏期限： 一般1～2年 注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保 藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管
二、保藏菌种的质量控制
目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地 保持菌种的优良性状不变。保藏时应定期检测菌 种活力，以确定保藏培养物的保藏期限，遗传稳 定性，保藏方法的可靠性。 测定指标：包括在保藏6个月、1年或更长时间后 存活百分率 ( 或存活单位 ) ；细胞群体的形态学特 征或一些特别的生化特征 ( 如代谢产物的产生、 酶活力、遗传特征及生化指标 ) 应在菌种保藏前 后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生 产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。
保藏期限： 10年以上
注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护 剂，如脱脂乳和蔗糖；忌猛烈开启；冻干后的 菌株无需进行冷冻保藏，便于运输销售，应用 广泛
四、细菌常用的几种保存方法
1、细菌穿刺培养： 一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。
具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好
的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续
安瓿管置于38-40℃水浴中，急速溶解后，开启安瓿接种
培养 注意事项：保护剂最终浓度为 10 ％ ( 甘油 ) 或 5 ％ ( 二甲亚 砜)；甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌
安瓿管
6、冷冻干燥保藏法
保藏方法：将混有保护剂的菌液入安瓿管后速 冻至 -70℃，用冷冻干燥机 -40℃下抽真空，使 真空度减压到 2.67 ～ 4.00Pa 条件下使冻结的细 胞悬液中的水分升华，菌种干燥成粉后密封安 瓿管，低温避光保藏
第一讲
微生物菌种保藏和培养
微生物菌种保藏技术 一、保藏原理
保藏原理：根据菌株生理生化特性，创造条件 ( 低 温、干燥、真空等)使菌体代谢活动处于休眠状态。 目的要求：经长期保藏后菌种存活健在；保证菌种 不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物 生产能力；不被杂菌污染。 注意事项：防止变异；要保藏休眠体；培养基宜贫 乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤。
几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存
放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在
适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封
Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。
2、细菌甘油保存（1）：
在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml
细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡
培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的
数菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自
溶、基因突变，应加以防治。不适宜作生产菌
种的长期保藏方法
2、液体石蜡覆盖保藏法
保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入 液体石蜡(事先灭菌)中，4℃左右保藏 保藏期限：一般为1～10年 注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保 藏株2～3年也应做一次存活试验。此方法简便 有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌
1. 斜面低温保藏法 2. 液体石蜡覆盖保藏法 3. 液氮超低温保藏法 4. 沙土管保藏法 5. 冷冻干燥保藏法 6. 普通冷冻保藏法
1、斜面低温保藏法(传代保藏)
保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面、穿刺、
疱肉（厌氧细菌用）基本培养基上传代，4℃左
右保藏
保藏期限： 一般1～3月
注意事项：此法简单经济，可用于实验室中多
分离纯化
1. 平板划线法
2. 倾注平板法
3. 涂布平板法
4. 富集培养法
5. 厌氧培养法
培养方法
1. 根据是否需氧分类——
好氧培养
厌氧培养
2. 根据培养基的状态分类——
固体培养
液体培养
应严格密封；不适宜微生物的长期保藏
5-1、液氮超低温保藏法
保藏方法：用冷冻保护剂制备菌悬液，混匀，取 0.5 ～ lml 分装玻璃安瓿管，酒精喷灯封口；先于 5℃冰箱中 3min，后置于金属容器，以1-2℃/min快速冷冻至细胞冻 结点(-35℃左右)，再以1℃/min控速冷冻至-50℃；迅速 移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存 保藏期限：一般可达10年以上 复苏方法：从液氮罐中取出后立即冰浴 10min；再迅速将
后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌
接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏 附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB 琼脂平板表面，于37度过夜。
2、细菌甘油保存（2）：
在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板
表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，
遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
2、菌种的复壮：
纯使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过
纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中
找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状 的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意 识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，
的保藏
3、载体保藏
保藏方法：是将微生物吸附在适当的载体，如 土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的
保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相
当广泛。 保藏期限：一般为1～10年。 注意事项：以沙土保存和滤约保存为主。
4、沙土管保藏法
保藏方法：制备沙土管斜面培养菌悬液 移入沙土管干燥后熔封低温保藏 保藏期限：因菌种而异，一般可达10年以上
国内外菌种保藏机构：
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌
种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不
衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)
美国的典型菌种保藏中心(ATCC)
英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
三、保藏方法
以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发
突变（正变）不断地从生产中选种
四、菌种的退化与复壮
3、控制衰退的措施：
控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不同类型的细胞进行接种传代 采用有效的菌种保藏方法
4、菌种复壮的措施：
纯种分离 通过寄主进行复壮 淘汰已衰退的个体
五、 接种、分离纯化与培养
接种方法
1. 斜面接种（基础，无菌操作）
2. 液体接种（固液、液液、液固）
3. 穿刺接种（半固体培养基） 4. 点植接种（霉菌菌落形态观察） 5. 平板划线接种（最常用） 6. 平板倾注接种（混合生长，稀释度是关键）
7. 平板涂布接种（表面生长，稀释度是关键）
8. 活体接种（限于病毒或部分病原微生物）
再ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，
振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存
管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方
法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的 cDNA文库。
四、菌种的退化与复壮
1、菌种的退化： 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的
存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、
注意事项：方法简单，保藏时间较长，复活方
便；适用于保藏耐干燥的芽孢或孢子，对干燥
敏感的细菌不宜采用
5、普通冷冻保藏法
保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种 加入菌种保护剂，密封于试管或 EP 管内，贮藏
于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中
保藏期限： 一般1～2年 注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保 藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管
二、保藏菌种的质量控制
目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地 保持菌种的优良性状不变。保藏时应定期检测菌 种活力，以确定保藏培养物的保藏期限，遗传稳 定性，保藏方法的可靠性。 测定指标：包括在保藏6个月、1年或更长时间后 存活百分率 ( 或存活单位 ) ；细胞群体的形态学特 征或一些特别的生化特征 ( 如代谢产物的产生、 酶活力、遗传特征及生化指标 ) 应在菌种保藏前 后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生 产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。
保藏期限： 10年以上
注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护 剂，如脱脂乳和蔗糖；忌猛烈开启；冻干后的 菌株无需进行冷冻保藏，便于运输销售，应用 广泛
四、细菌常用的几种保存方法
1、细菌穿刺培养： 一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。
具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好
的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续
安瓿管置于38-40℃水浴中，急速溶解后，开启安瓿接种
培养 注意事项：保护剂最终浓度为 10 ％ ( 甘油 ) 或 5 ％ ( 二甲亚 砜)；甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌
安瓿管
6、冷冻干燥保藏法
保藏方法：将混有保护剂的菌液入安瓿管后速 冻至 -70℃，用冷冻干燥机 -40℃下抽真空，使 真空度减压到 2.67 ～ 4.00Pa 条件下使冻结的细 胞悬液中的水分升华，菌种干燥成粉后密封安 瓿管，低温避光保藏
第一讲
微生物菌种保藏和培养
微生物菌种保藏技术 一、保藏原理
保藏原理：根据菌株生理生化特性，创造条件 ( 低 温、干燥、真空等)使菌体代谢活动处于休眠状态。 目的要求：经长期保藏后菌种存活健在；保证菌种 不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物 生产能力；不被杂菌污染。 注意事项：防止变异；要保藏休眠体；培养基宜贫 乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤。
几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存
放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在
适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封
Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。
2、细菌甘油保存（1）：
在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml
细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡
培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的
数菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自
溶、基因突变，应加以防治。不适宜作生产菌
种的长期保藏方法
2、液体石蜡覆盖保藏法
保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入 液体石蜡(事先灭菌)中，4℃左右保藏 保藏期限：一般为1～10年 注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保 藏株2～3年也应做一次存活试验。此方法简便 有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌
1. 斜面低温保藏法 2. 液体石蜡覆盖保藏法 3. 液氮超低温保藏法 4. 沙土管保藏法 5. 冷冻干燥保藏法 6. 普通冷冻保藏法
1、斜面低温保藏法(传代保藏)
保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面、穿刺、
疱肉（厌氧细菌用）基本培养基上传代，4℃左
右保藏
保藏期限： 一般1～3月
注意事项：此法简单经济，可用于实验室中多
分离纯化
1. 平板划线法
2. 倾注平板法
3. 涂布平板法
4. 富集培养法
5. 厌氧培养法
培养方法
1. 根据是否需氧分类——
好氧培养
厌氧培养
2. 根据培养基的状态分类——
固体培养
液体培养
应严格密封；不适宜微生物的长期保藏
5-1、液氮超低温保藏法
保藏方法：用冷冻保护剂制备菌悬液，混匀，取 0.5 ～ lml 分装玻璃安瓿管，酒精喷灯封口；先于 5℃冰箱中 3min，后置于金属容器，以1-2℃/min快速冷冻至细胞冻 结点(-35℃左右)，再以1℃/min控速冷冻至-50℃；迅速 移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存 保藏期限：一般可达10年以上 复苏方法：从液氮罐中取出后立即冰浴 10min；再迅速将