菌种的保藏和培养(第一讲).
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
微生物菌种的保存方法
微生物菌种的保存方法微生物菌种如何保存呢?下面是小编收集整理的微生物菌种的保存方法，希望对您有所帮助!一、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
二、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
菌种制作及保藏
第六节 消毒与灭菌
一、概念 1、 灭菌 ：在一定范围内彻底杀灭物料及其容 、 器中的一切微生物。 器中的一切微生物。 2、消毒： 用物理或化学的方法，消灭物体表 、消毒： 用物理或化学的方法， 面或环境中一部分微生物的措施。 面或环境中一部分微生物的措施。也称简易非 彻底的灭菌。 彻底的灭菌。在医学上泛指对病原微生物的杀 灭。
加棉塞
质检
三、 各级菌种的培养时间 1、试管种 7-10天 、 天 2、二级种 30-60天 、 天 3、三级种 30-60天 、 天
四、全年菌种生产时间安排 时间 名称 香菇 木耳 银耳 金针菇 侧耳类 猴头菇 双孢菇 草菇 段木 2-4月 月 3-4月 月 3-4月 月 袋料 8-9月 月 2-3月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 9-10月(秋) 月春 月秋 11-1月 月 2-4月(春) 8-10月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 9-10月 月 6-8月 (华中 4-10月(华南 华中) 华南) 月 华中 月 华南
三、常用药品 1、HgCl2 、 2、C2H5OH（60%—70%） 、 （ ） 3、KMnO4 、 4、CH3COOOH（过氧乙酸） 、 （过氧乙酸） 5、HCHO(38%) 、 6、C6H4CH3OH（来苏尔） 、 （来苏尔） 7、C6H5OH 、 8、C21H38NB（新洁尔灭） 、 （新洁尔灭） 9、气雾消毒盒 、
二、培养基的类型及应用 (一)、按培养基的物理状态分液体培养基、固化 一 、按培养基的物理状态分液体培养基、 培养基和固体培养基 (二)、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 二 、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 半合成培养基和合成培养基 (三)、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 三 、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、棉 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、木块培 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、 养基、粪草培养基等。 养基、粪草培养基等。
发酵工程原理与技术_江南大学-陈坚-7第七章生产菌种的扩大培养与保藏
– 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
– 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
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第二节 种子质量的控制
素含量要高
• 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
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2，培养条件 （1）温度 （2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的 培养基外，有足够的通气量可以提高种子质 量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中 将通气充足和不足两种情况下得到的种子分 别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍 。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种 子罐的通气量小对发酵有利。
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(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
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二、啤酒酵母的扩大培养
• 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
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• 措施
– 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使 用
– 严格控制灭菌后培养基的质量 – 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一
定时间 – 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源
，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂 的有机氮源
• 通常接种量，细菌1~5%，酵母 菌5~10%，霉菌7~15%，有时
20~25%
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三、种子质量的控制措施
• 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐 中所表现出来的生产能力。因此首先必 须保证生产菌种的稳定性，其次是提供 种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。
生产菌种的培养与保存
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几 度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生 相变；
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中 保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰 箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
种子扩大培养是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入 试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质 量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 。
种子扩培的目的
接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧， 则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专 用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置 于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
菌种保藏方法范文
菌种保藏方法范文菌种保藏是指将具有特定遗传性状的菌种保持在一定的条件下存活和保存，以便于后续的研究和利用。
菌种保藏的目的是保持菌种的稳定性、纯度和活力。
下面将对常见的菌种保藏方法进行详细介绍。
1.冷冻保藏法：冷冻保藏法是最常见和常用的菌种保存方法之一、该方法是将菌种在适宜的培养基上生长至适宜的阶段，然后通过添加甘油或其他保护剂来增加菌种的耐冻存活力，并放入低温环境下冷冻保存。
通常使用-20℃或更低的温度进行保存。
这种方法简单易行，成本较低，在短时间内能够保持菌株的复原性很好。
2.干燥保藏法：干燥保藏法又称为脱水保藏法，是将菌种长时间保存于干燥状态中。
先将菌种培养至适宜的生长阶段，然后用无菌方法将菌种制成干燥菌粉，放入干燥瓶中密封保存。
常见的干燥剂有二氧化硅凝胶、无水CaCl2等。
干燥保藏法保存的菌种潜伏期长，比较安全可靠，但复苏的条件较为苛刻。
3.液氮保藏法：液氮保藏法又称为低温保存方法，是将菌种保存在液态氮中。
通过将菌种培养至适宜生长阶段后，将其转接入试管中，用无菌方法加入等体积的冷冻保护剂（例如甘油），放入液氮中保存。
液氮的温度达到-196℃，在这种环境下菌种可以长时间保存，但需要特殊的设备和条件。
4.胶体保藏法：胶体保藏法是将菌种培养至适宜生长阶段，然后将其与无菌明胶混合均匀，制成菌胶球，通过培养基中的各种成分供应菌种的生长和维持菌株的复原性。
这种保藏方法具有较长的复苏潜伏期，并且易于携带和传递，是一种较为理想的保存方法。
5.冷冻干燥保藏法：冷冻干燥保藏法是将菌种通过冷冻干燥的方法进行保存。
首先将菌种培养至适宜生长阶段，然后用无菌方法将菌种在-40℃或更低温度下冷冻干燥，形成冷冻干燥粉末。
这种方法保存的菌种潜伏期长，但复苏条件较为苛刻。
除了以上的常见保存方法，还有一些新兴的菌种保藏方法，例如微柱保存法、冷冻解冻保存法等。
这些方法在不同的实验室和研究领域可能有着不同的适用性和优势。
综上所述，菌种保藏方法有多种多样，每一种方法都有其自身的特点和适用范围。
菌种的传代、保藏及菌液ppt课件
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
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严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储 备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种 进行纯度和属性确认外，还应对每一次传 代都进行确认的质量控制系统。因为微生 物菌种从上一代传到下一代时，很可能发 生污染或变异，因此每次传代中至少要对 菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必 要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到 污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实 2019 验。
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。 2019 -
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3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
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严格控制菌种的传代
避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。 1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转 菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代） 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后， 挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管 ， 保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工 作用菌种（为第三代） 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于 试验
分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）
菌种保存&培养基使用
代的定义：每接种一次即为一代（有在新鲜的培养基上生长过程)
传代示意图：
原始菌种
第一代
QC
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S1
S2
S3
3M Food Safety
菌种的质量控制
菌种鉴别
通过一系列的检查来确认菌种的纯度和活性。
鉴别方法: 传统的鉴别方法：菌落形态、个体形态、孢子形态、生化特征等。
商业的鉴别方法：API 、Vitek等。
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3M Food Safety
斜面保存法 吕氏血清斜面
白喉棒状杆菌可保存在该培养基上，其成份为1﹪ 葡萄糖肉汤（pH7.4）1份，无菌牛血清或兔血清3份。白 喉棒状杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态 典型。如在培养基中再加入5-10﹪的中性甘油，则培养 出的白喉棒状杆菌异染颗粒更为明显，但24小时后即衰 老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍。吕 氏血清斜面置 4 ℃冰箱可保存2周至1个月。
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3M Food Safety
菌种保藏
样品分离菌库 环境监控菌库 标准菌种菌库 CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）或 CMCC（B） B — 代表细菌、F —代表真菌 ATCC ——美国标准菌种收藏所
著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维
代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养， 并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式， 新培养物对接种培养物而言就称为一代。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。
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3M Food Safety
中国医学菌种保藏中心提供藏中心提供的标准菌株
3M Food Safety
菌种保存、使用及培养基的验收
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1、斜面低温保藏法(传代保藏)
保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面、穿刺、
疱肉（厌氧细菌用）基本培养基上传代，4℃左
右保藏
保藏期限： 一般1～3月
注意事项：此法简单经济，可用于实验室中多
接种方法
1. 斜面接种（基础，无菌操作）
2. 液体接种（固液、液液、液固）
3. 穿刺接种（半固体培养基） 4. 点植接种（霉菌菌落形态观察） 5. 平板划线接种（最常用） 6. 平板倾注接种（混合生长，稀释度是关键）
7. 平板涂布接种（表面生长，稀释度是关键）
8. 活体接种（限于病毒或部分病原微生物）
的保藏
3、载体保藏
保藏方法：是将微生物吸附在适当的载体，如 土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的
保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相
当广泛。 保藏期限：一般为1～10年。 注意事项：以沙土保存和滤约保存为主。
4、沙土管保藏法
保藏方法：制备沙土管斜面培养菌悬液 移入沙土管干燥后熔封低温保藏 保藏期限：因菌种而异，一般可达10年以上
第一讲
微生物菌种保藏和培养
微生物菌种保藏技术 一、保藏原理
保藏原理：根据菌株生理生化特性，创造条件 ( 低 温、干燥、真空等)使菌体代谢活动处于休眠状态。 目的要求：经长期保藏后菌种存活健在；保证菌种 不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物 生产能力；不被杂菌污染。 注意事项：防止变异；要保藏休眠体；培养基宜贫 乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤。
再加入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，
振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存
管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方
法的优点在、菌种的退化： 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的
存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、
保藏期限： 10年以上
注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护 剂，如脱脂乳和蔗糖；忌猛烈开启；冻干后的 菌株无需进行冷冻保藏，便于运输销售，应用 广泛
四、细菌常用的几种保存方法
1、细菌穿刺培养： 一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。
具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好
的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续
以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发
突变（正变）不断地从生产中选种
四、菌种的退化与复壮
3、控制衰退的措施：
控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不同类型的细胞进行接种传代 采用有效的菌种保藏方法
4、菌种复壮的措施：
纯种分离 通过寄主进行复壮 淘汰已衰退的个体
五、 接种、分离纯化与培养
分离纯化
1. 平板划线法
2. 倾注平板法
3. 涂布平板法
4. 富集培养法
5. 厌氧培养法
培养方法
1. 根据是否需氧分类——
好氧培养
厌氧培养
2. 根据培养基的状态分类——
固体培养
液体培养
国内外菌种保藏机构：
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌
种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不
衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)
美国的典型菌种保藏中心(ATCC)
英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
三、保藏方法
安瓿管置于38-40℃水浴中，急速溶解后，开启安瓿接种
培养 注意事项：保护剂最终浓度为 10 ％ ( 甘油 ) 或 5 ％ ( 二甲亚 砜)；甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌
安瓿管
6、冷冻干燥保藏法
保藏方法：将混有保护剂的菌液入安瓿管后速 冻至 -70℃，用冷冻干燥机 -40℃下抽真空，使 真空度减压到 2.67 ～ 4.00Pa 条件下使冻结的细 胞悬液中的水分升华，菌种干燥成粉后密封安 瓿管，低温避光保藏
注意事项：方法简单，保藏时间较长，复活方
便；适用于保藏耐干燥的芽孢或孢子，对干燥
敏感的细菌不宜采用
5、普通冷冻保藏法
保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种 加入菌种保护剂，密封于试管或 箱(-20℃)中
保藏期限： 一般1～2年 注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保 藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管
几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存
放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在
适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封
Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。
2、细菌甘油保存（1）：
在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml
细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡
培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的
保存管内，密封，在乙醇－干冰或液氮中冻结
后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌
接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏 附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB 琼脂平板表面，于37度过夜。
2、细菌甘油保存（2）：
在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板
表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，
应严格密封；不适宜微生物的长期保藏
5-1、液氮超低温保藏法
保藏方法：用冷冻保护剂制备菌悬液，混匀，取 0.5 ～ lml 分装玻璃安瓿管，酒精喷灯封口；先于 5℃冰箱中 3min，后置于金属容器，以1-2℃/min快速冷冻至细胞冻 结点(-35℃左右)，再以1℃/min控速冷冻至-50℃；迅速 移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存 保藏期限：一般可达10年以上 复苏方法：从液氮罐中取出后立即冰浴 10min；再迅速将
二、保藏菌种的质量控制
目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地 保持菌种的优良性状不变。保藏时应定期检测菌 种活力，以确定保藏培养物的保藏期限，遗传稳 定性，保藏方法的可靠性。 测定指标：包括在保藏6个月、1年或更长时间后 存活百分率 ( 或存活单位 ) ；细胞群体的形态学特 征或一些特别的生化特征 ( 如代谢产物的产生、 酶活力、遗传特征及生化指标 ) 应在菌种保藏前 后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生 产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。
遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
2、菌种的复壮：
纯使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过
纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中
找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状 的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意 识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，
数菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自
溶、基因突变，应加以防治。不适宜作生产菌
种的长期保藏方法
2、液体石蜡覆盖保藏法
保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入 液体石蜡(事先灭菌)中，4℃左右保藏 保藏期限：一般为1～10年 注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保 藏株2～3年也应做一次存活试验。此方法简便 有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌