放射免疫测定法

(一)、液相法
已知放射标记抗原
待检非标记抗原
分离
+
+
抗体
抗原
抗原抗体结合
沉淀物
上清液中
抗原抗体复合物 游离抗原
（二）、固相法
1. 直接法IRMA示意图
标记抗体 抗原
固相抗原
离心
测定
2. 双位点法IRMA示意图
抗体 抗原
标记抗体
洗涤
测定
八、免疫放射分析（ IRMA ）
• 基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物， 并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段除去多余的游离抗 体，测量抗原抗体复合物的放射性。
六、放射免疫分析的质量控制
◆ 误差和放射免疫误差的来源 (1) (2)放射免疫分析误差来源
◆ 掌握质量控制与质控样品 (1) (2)质量控制样品
◆ 质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、稳定 性、临床有效性。
◆ 实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和批间重 现性评价。
◆
七、RIA技术类型和应用
二、RIA原理
基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗 原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑 制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）的或游离（ *Ag ）的放 射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的 一种超微量分析技术。
RAI属超微量分析技术，10–12～10–15g。常用于胰岛素、生长激 素、药物等微量物质的测定。
B/F 1
斜率＝－KA
0
3
Ag-Ab浓度
亲和力测定（Scatchard作图）
C
复
合 100
物 放
A
B
射 性
50
0
12345
6
Log竞争剂浓度
特异性的测定－－交叉反应检测
交叉反应率 ＝A50/B50×100％
B%
100 80 60 40 20 0
100 1000 10000 100000
抗血清稀释度
一、基本概念
荧光免疫分析技术：是以荧光素标记抗体或抗原，使其
与相应抗原或抗体结合后，借助荧光检测仪察看荧光现 象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的存在、定位 和分布情况或检测受检标本中抗原或抗体的含量。
荧光(fluorescence)：物质在吸收光子后，在极短时间
（10-8~10-9s）内激发分子放出波长比激发光波长为长 的可见光。
免疫分析系统(DEL FIA)
常见荧光色素及其标记方法和用途
荧光素
最大吸收 光谱(nm)
最大发射 光谱(nm)
荧光颜色
标记方法
主要用途
异硫氰酸荧光黄 （FITC）
490-495
520-530
亮黄绿色荧光 搅拌法 透析法 单、双标记
四乙基罗丹明
（RB200）
575
595~600 明亮橙色荧光 搅拌法
对标准抗原的基本要求 (1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。 (2) (3) (4)标准抗原应有很好的稳定性。
对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要 有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。
(1) (2) (3)
衡量抗体质量的指标
亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提 特异性:不受交叉反应物质影响的程度 滴度:抗体的效价——抗体实际应用时的稀释倍数
❖ SLFIA主要用于检测庆大霉素、卡那霉素等半抗原性药物
4. 均相荧光免疫测定（HoFIA）
❖ 基本原理：采用二种 荧光素分别标记抗原 和抗体，当抗原抗体 结合后，通过荧光激 发传递使一种荧光被 吸收，其吸收量与样 品中待测物质成正比， 由标准曲线推算出含 量。
细胞抗原
荧光标记抗体
wk.baidu.com
细胞被荧光 抗体着色
1.样品或标准品 2.标记物 3.抗血清 分离剂
混匀 温浴
混匀
立即
1.加样 2.加分离剂 3.离心 4.去上清分离 5.测量
动态平衡体系中: *Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力 *Ag和Ab的量恒定 Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数
*Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负 相关函数关系测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育
双标记
四甲基异硫氰酸罗
丹明(TRITC)
550
600-620 橙红色荧光 搅拌法 透析法 双标记
藻红蛋白(PE) 490-560 575
红色荧光
交联法
双标记
7-氨基-4-甲基香豆 素(AMC)
354
430
蓝色荧光
交联法
双、多标记
镧系元素： Eu3+、 Sm3+、Tb3+
340
613
持续时间较长 双功能螯合剂 (10-1000μs)
第四节、放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
一、基本概念
放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的原理， 以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或 定量测定待检标本中抗体或抗原的量。
同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某种 元素所包含的若干种核素。
Ag
*Ag Ab
Bound Free
B
F
B/F
0.67 0.33 2
0.50 0.50 1
0.33 0.67 0.5
0.17 0.83 0.2
竞争放射分析原理示意图
常用标记放射性同位素及其性质
放射性元素 半衰期
射线种类及能量（百万电子伏特）
β
γ
14C
5720年 0.155
－
3H
12.5年 0.0189
标准曲线的基本数学函数式
放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从
%
/
75
结 合
未
结 50
合
的
放 30
射
活
性 （
10
）0
待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系
1
10
100
未标记抗原浓度（ng/ml)
1000
RIA竞争抑制曲线类型
注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度
四、建立放射免疫分析方法的必备条件
结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法
沉淀法 加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心
吸附法 调pH值于γ球蛋白等电点，加入适当浓度PEG或中性盐
过滤法 小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离
双抗体法 入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心
固相法 抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤
❖ FEIA主要用于激素、肿瘤标记物、心血管标记物、肝炎等病毒标记物、自身 抗体、维生素、药物浓度等项目的测定。
FEIA所用的酶及其相应的底物和产物
酶
底物
β半乳糖苷酶（α-G） MUG
产物
激发光波长 （nm）
发射光波长 （nm）
MU
360
450
碱性磷酸酶(AP)
MUP MU
360
450
辣根过氧化物酶(HRP) HPA 二聚体
单、双、多 标记
四、荧光免疫测定技术
➢ 荧光酶免疫分 ➢ 底物背景荧光免疫分析 ➢ 荧光偏振免疫检测 ➢ 均相免疫测定 ➢ 时间分辨荧光免疫检测
1. 荧光酶免疫分析(FEIA)
❖ 基本原理：利用具有潜在荧光的物质作为酶标抗体或抗原的 显示手段，受酶作用分解出荧光色素后进行免疫分析。本法 兼有酶免疫测定的累积放大性和荧光免疫测定的高度敏感性 的优点。缺点：测定结果受生物样品背景荧光干扰。
电泳法
分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质
亲和层析法
利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质
高效液相层析法 分离效果好、快速
ConA吸附法
分离标记糖蛋白
二、RIA操作程序
配制已知浓度系列标准抗原（Ag） 加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育 分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F） 用γ计数器测量放射性计数 根据标准曲线或计算机直接算出
317
414
脱氢酶
NADH NAD
450
❖注：MUG：4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷；MU：4-甲基伞形酮； MUP： 4-甲基伞形酮磷酸盐；HPA：对羟基苯甲酸； NADH ：还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸； NAD：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
2. 底物标记荧光免疫分析（SLFIA）
❖ 基本原理：利用经化学修饰的某些底物标记抗原，形成底物 （S）与分析配基（L）的稳定共价结合物（S-L），免疫反应 结束后，加入相应酶系统催化游离S-L上的底物，释出具有强 荧光的色素基团，借荧光检测进行免疫定量分析。
反应试剂
三种 标记抗原
二种 标记抗体
分离方法
抗原只需一个 抗原决定簇
一般需单抗作分离剂，抗原 需两个或两个以上决定簇
待测抗原复合物 与待测抗原呈负相关 放射性
非特异性结合 待检抗原性质
主要影响高剂量反应 半抗原及大分子
与待测抗原呈正相关
主要影响低剂量反应 蛋白质、酶等生物大分子
第五节、荧光免疫分析 Immunofluorescence assay, IFA
放射性核素标记物制备的主要方法
氯胺T法
活化NaI中放射性碘离子
乳过氧化酶法 催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化
双酶标记法
葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物
氯甘脲标记法 活化NaI中放射性碘离子
放射性同位素标记化合物的纯化方法
凝胶过滤法 离子交换法 透析法
分离标记蛋白与无机碘 用于分离纯化短肽标记物 将标记蛋白与小分子化合物很好地分离
❖ SLFIA主要用于检测庆大霉素、卡那霉素等半抗原性药物
SLFIA示意图
底物
抗原
酶
荧光基团
无反应
产生荧光
3. 荧光偏振免疫检测（FPIA）
❖ 基本原理：荧光素标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特 异性抗体，反应后用单一平面偏振的光源照射，荧光素被 激发产生偏振荧光。偏振荧光的强度与分子转动的速度成 反比。标记抗原与抗体的复合物分子量大，旋转慢，偏振 荧光强；游离标记抗原的分子量小，偏振荧光弱。
－
125I
60天 －
0．035
131I
8.05天
0.608，0.335，0.250
0.364，0.637， 0.722
125I的优点
29种同位素，125I最为常用。 半衰期适中（60天），易于商品化和储存，也利于废物处理； 发射低能35kV γ线易于测量，井型闪烁效率高 不发射β粒子，标记物自分解速度低 标记过程中，标记物免疫损伤小 化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而广泛应用
荧光素(fluorescein)：凡能吸收激发光产生明显荧光，
并可作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。
IFA方法学研究进展
➢ 20世纪40年代 Coons等创建荧光抗体检测技术(FIA) ➢ 20世纪80年代 Abbott公司开发荧光偏振免疫测定（FPIA） ➢ 1981年 荧光增强标记免疫分析（FIA） ➢ 1983年 Soini和Kojola建立时间分辨光荧光免疫分析(TRFIA) ➢ 20 世纪90 年代 EG&G Wallac 公司推出 “解离增强镧系荧光
抗体滴度测定
五、放射免疫分析的设计方法
◆ 标讥抗原和抗体用量最佳化设计: 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。
◆
1、 2、标准曲线工作范围 ◆
◆ 反应介质 ◆ 反应容积与温度及时间
1、缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使 非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。 2、抗原、抗体结合反应的平衡结合常数K与温度有关，必须 通过实验来确定最佳工作条件。 ◆ 与F分离方法选择 ◆ 样品采集与保存
SPA法
金黄色葡萄球菌A蛋白促使AgAb较快速度沉淀
三、RIA法标准曲线
标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲
线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系， 也称为剂量反应曲线。
标准曲线的手工绘制形态
标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。
Ag *Ab
Ag*Ab
单位点IRMA
多量标记的抗体 抗原
双位点IRMA
固相抗原
固相抗体
抗原
过量标记的抗体
IRMA和RIA曲线形态比较
结 合 率 （
RIA 结 合 率 （
IRMA
）
）
% %
Ag剂量
Ag剂量
IRMA与RIA的工作原理的主要区别
项目 反应机制
RIA 竞争性反应
IRMA
非竞争性全量反应灵敏度提 高（10-100倍）
核素（nuclide）：凡原子核具有特定的质子数和中子数 并处于一定能量状态的原子。
放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子数 的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放射出 一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。
RIA方法学研究进展
1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA） 1960年 竞争性蛋白结合分析（CPBA） 1968年 Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA） 1968年 放射受体分析法(RRA) 1971年 Addison和Hales建立双位点或夹心IRMA