单核细胞增生李斯特菌检验PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养基中，于30℃培养24h-48h，李斯特菌 有动力，呈伞状生长。 溶血实验： 将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格 ，从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每 格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李 斯特菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克 李斯特菌)，
19
于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底 部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产 生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶 血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环 。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌 ，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来 确证李斯特氏各种菌。
7
表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板 上的菌落特征
选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科 玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色 晕圈.
PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌 落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑 色凹陷
8
L.M在 Chromagar培养基生长特征
9
10
L.M在OXA培养基生长特征
16
初筛及纯培养 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典
型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李 糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰 酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上 划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖 阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在 TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
17
接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h
木糖-，鼠李糖+ 鉴定
结ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ报告
5
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于 30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入 10mL LB2增菌液中二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选 择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板 上，于37℃培养24 h，观察各个平板 上生长的菌落,各个平板上的菌落特征 见表1。
11
L.M在PALCAM培养基生长特征
12
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很 难与杂菌区分
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易 与杂菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分 ，对高污染食品中的杂菌抑制性较差
13
染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片
检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为 0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制 成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌 出现轻微旋转或翻滚样的运动。
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
－
V
＋
＋
伊氏李斯特氏菌
(L.ivanovii) (绵羊)
＋
＋
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
英诺克李斯特氏菌
(L.innocua) (无害)
－
－
＋
＋
＋/＋
－
V
－
＋
注：＋阳性；－阴性；V反应不定。
18
动力试验 将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM
3
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册
1.定性检测 2.定量检测
4
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h 0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基
PALCAM琼脂
36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
1
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新
的分类学研究表明，其分为六个种：
单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
6
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
37℃24h－48h， 30℃24h－ 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
37℃18h-24h, 蓝色菌落周围 呈白色晕圈
在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核
增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动
物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类
的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌
中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
2
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主 要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
14
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物 中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状 ，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些 细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性 厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛 ，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动 消失。
15
1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
菌种
单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes)
溶血反应 ＋
协同溶血 葡萄糖
＋
＋
麦芽糖 ＋
MR-VP ＋/＋
甘露醇 －
鼠李糖 ＋
木糖 －
七叶苷 ＋
格氏李斯特氏菌 (L.grayi)
斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
＋
－
－
＋
＋
＋
19
于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底 部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产 生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶 血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环 。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌 ，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来 确证李斯特氏各种菌。
7
表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板 上的菌落特征
选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科 玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色 晕圈.
PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌 落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑 色凹陷
8
L.M在 Chromagar培养基生长特征
9
10
L.M在OXA培养基生长特征
16
初筛及纯培养 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典
型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李 糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰 酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上 划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖 阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在 TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
17
接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h
木糖-，鼠李糖+ 鉴定
结ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ报告
5
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于 30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入 10mL LB2增菌液中二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选 择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板 上，于37℃培养24 h，观察各个平板 上生长的菌落,各个平板上的菌落特征 见表1。
11
L.M在PALCAM培养基生长特征
12
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很 难与杂菌区分
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易 与杂菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分 ，对高污染食品中的杂菌抑制性较差
13
染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片
检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为 0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制 成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌 出现轻微旋转或翻滚样的运动。
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
－
V
＋
＋
伊氏李斯特氏菌
(L.ivanovii) (绵羊)
＋
＋
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
英诺克李斯特氏菌
(L.innocua) (无害)
－
－
＋
＋
＋/＋
－
V
－
＋
注：＋阳性；－阴性；V反应不定。
18
动力试验 将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM
3
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册
1.定性检测 2.定量检测
4
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h 0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基
PALCAM琼脂
36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
1
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新
的分类学研究表明，其分为六个种：
单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
6
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
37℃24h－48h， 30℃24h－ 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
37℃18h-24h, 蓝色菌落周围 呈白色晕圈
在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核
增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动
物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类
的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌
中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
2
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主 要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
14
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物 中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状 ，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些 细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性 厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛 ，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动 消失。
15
1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
菌种
单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes)
溶血反应 ＋
协同溶血 葡萄糖
＋
＋
麦芽糖 ＋
MR-VP ＋/＋
甘露醇 －
鼠李糖 ＋
木糖 －
七叶苷 ＋
格氏李斯特氏菌 (L.grayi)
斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
＋
－
－
＋
＋
＋