单核细胞增生李斯特菌检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
单核细胞增生李斯特氏菌及检验
单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
一、生物学特性1、形态与染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培育特性该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培育基上，菌落初始很小，透亮，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
※初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、
鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续 进行鉴定。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以 分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉 子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
※ 确认实验-鉴定 ：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试 验cAMP(可选项目)
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三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※典型菌落计数以及对应的计算公式的应用 ※计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。 ※计算公式1计算公式2.
04
三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※样品的接种 ※根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀 液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用 无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
※小鼠毒力试验(可选项目)
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二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
单核细胞李斯特氏菌检验原始记录第二法平板计数法
1.1—计算系数；
d一稀释因子（第一稀释度）。
结果报告（根据公式计算结果,报告每g（m1）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU∕g（m1）表示；如T值为0,则以小于I乘以最低稀释倍数报告。）
报告人报告日期复核人复核日期
培养基及试剂：
缓冲葡萄糖蛋白陈水：m1配制日期：
李氏增菌肉汤1B：m1配制日期：
李斯特氏菌显色培养基：m1配制日期：
实验过程：
1.样品稀释：
根据样品状态，无菌操作，称取25g∕吸取25m1样品，加入到装有225m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌均质袋中均质，制成1:10样品匀液。
用Im1无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液Im1,沿管壁缓慢注于盛有9m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支In1I无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
3.培养
在通常情况下，涂布后，将平板静置10min,如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36C±IC培养Ih;等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±IC培养24-48hJ_/__/时〜_/_/时）
典型菌落计数和确认：注：“一”表示在选择性平板中无可疑菌落生长。
样品编号
菌落特征以产品说明为准
第一稀释度：
d）所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有」
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CF时，应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平标
收，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU
）CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
＋
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V
－
＋
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。
单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。
以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。
2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。
3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。
可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。
4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。
可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。
5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。
可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。
此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。
需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。
此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。
单核细胞增生李斯特氏菌检测原始记录表-
受控编号：
单核细胞增生李斯特氏菌检测原始记录表
检测项目：☑单核细胞增生李斯特氏菌检测依据：☑GB 4789.30-2016
样品状态：□液态☑固态□完好□已开封□其他：检测日期： 2023.12.4-12.6 环境条件： 25 ℃ 47 ％ RH
存放条件：□室温□冷藏☑冷冻检测仪器：☑生化培养箱WTHF1010A1-002 □电热恒温培养箱 WTHK1001A-1001
样品处理：1单核细胞增生李斯特氏菌检验：按无菌操作称取25g（mL）样品，加入225mL LB1增菌液中，研成匀浆制成混悬液，置30℃恒温培养24h，取上述增菌液0.1mL接种至10mL LB2增菌液中，混匀后置30℃恒温培养18h~24h。
委托单编号：
备注：1.“+”表示选择性平板上有可疑或典型菌落生长或生化试验呈阳性，“-”表示选择性平板上无可疑或典型菌落生长或生化试验呈阴性。
2.“ND”表示未检出。
检验员：复核人：审核人：。
FAPAS_乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论
分析检测FAPAS乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论刘 霓（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110000）摘 要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，本实验室参加了FAPAS分析实验室能力验证机构组织的实验室能力验证，分别运用国标方法、分子生物学方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对样品进行检测鉴定。
结果表明，M224d02-A样品检出单核细胞增生李斯特氏菌，M224d02-B样品检出英诺克李斯特菌，属于李斯特氏菌属。
2个样品检验结果均取得满意结果。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；FAPAS考核；李斯特菌Analysis and Discussion About the Verification Resultsof Listeria monocytogenes in Milk Powder from FAPASLaboratoryLIU Ni(Liaoning Inspection Examination and Certification Center, Shenyang 110000, China) Abstract: To strengthen the detection power of Listeria monocytogenes in food, our laboratory participated in proficiency testing on Listeria monocytogenes detection in foods which was organized by Food Analysis Performance Assessment Scheme (FAPAS). We used 3 methods for the test, respectively national standard method, molecular biology method and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method. Listeria monocytogenes were detected in M228d02-A. Listeria innocua belonged to Listeria sp. were detected in M228d02-B. The test results of 2 samples were outstanding grade.Keywords:Listeria monocytogenes; FAPAS proficiency testing; Listeria sp.李斯特菌属（Listeria sp.）是一种革兰氏阳性菌，在自然环境中广泛存在，一般认为它包括单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）、英诺克李斯特菌（L.innocua）等多种。
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂(一)
单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂(一)单核细胞增生李斯特氏菌（LM）是一种由李斯特氏菌属（Listeria）引起的感染性疾病，该疾病主要感染免疫功能低下人群，通常会导致败血症和脑膜炎等严重并发症，严重威胁人类健康。
因此，开发出一种快速、敏感、高效的LM检验培养基和试剂至关重要，这可以加速LM 的检测和诊断，有效地减少疾病的传播。
一. 检验培养基1. 构成成分：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基是由肉汤、肉汤胰蛋白胨、乳糖、黄曲霉素、普鲁兰甲酸和酵母提取物等组成的。
2. 作用：肉汤是一种富含氮源和其他必需营养成分的培养基，在培养微生物中发挥着重要的作用。
肉汤胰蛋白胨是一种蛋白质水解物，可为细菌提供营养和生长因子，促进其繁殖。
乳糖则是一种碳源，能够促进细胞的代谢和繁殖。
黄曲霉素作为一种广谱抗生素，可以有效地抑制杂菌的生长。
普鲁兰甲酸和酵母提取物则可以用来增加LM在培养基上的特异性和灵敏度。
3. 优点：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基在培养LM时具有快速、敏感、特异性好等优点，可以大大缩短LM的检测时间，确保病菌的检测率。
二. 检验试剂1. 依赖性及非依赖性试剂：检验试剂可分为依赖和非依赖试剂。
依赖试剂需要依赖细菌代谢产物或生长结果的变化来作出结果，如葡萄糖酶试剂。
而非依赖试剂则不需要依赖于细菌代谢的结果，如反应纸片试剂。
2. LM检测常用试剂：LM检测常用试剂包括气体生成剂试剂和反应纸片试剂。
前者是一种单元试剂，含有半胱氨酸脱氨酶和甲酸氢化酶等催化剂，当培养基内细菌产生气体时，该试剂会发生颜色变化，表示LM检测阳性。
而反应纸片试剂则能够迅速地检测LM生长的结果，并呈现出明显的颜色变化。
这种试剂具有使用方便、结果稳定等优点。
3. 优点：LM检验试剂具有便于使用、结果稳定和灵敏度高等特点，可以有效地加速LM的检测和诊断，从而避免其传播和蔓延。
结论：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂是一对极为重要的检测手段，在LM的检测过程中发挥着至关重要的作用。
单核细胞增生李斯特菌检验
允许使用经过确 认的商业化生产 的单核增生李斯 特氏菌菌株鉴定 试验，但没列明 具体试剂盒名称
检测程序
目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌 肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉汤 （FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB （Listeria enrichment broth）和BLEB （buffered Listeria enrichment broth）
半量Fraser ISO 肉汤 11290（30℃， 1:1996（E） （ ） 24±2h）
OXA和 PALCAM Fraser肉汤 （30、35或37℃， （35或37℃， 24-48h，） 48±2h） PALCAM平板微 需氧或好氧条件 培养
蓝色菌落*；过氧化氢酶；革 兰氏染色；动力试验或典型 运动*；溶血试验；糖发酵试 验；协同溶血；送参考实验 室（血清或噬菌体分型）
选择性增菌肉汤的比较和筛选
通过对高污染及低污染食品进行增菌效 果比对，结果表明： LB肉汤的增菌效果 最佳 BLEB更适于背景微生物较少的熟食样品 修订标准选择LB增菌肉汤
分离培养基的比较和筛选
方法 原国标 AFNOR FDA USDA Health Welfare Canada 培养基 MMA OXA、PALCAM MMA、OXA、LPM MOX PALCAM、OXA
修订原则
参照FDA、AOAC、ISO、 AFNOR等有 关标准，使本标准更接近现行国际标准 保持与原标准的连续性
修订依据
FDA BAM (2001) chapter10 AOAC 975.55 987.09 ISO11290-1 AFNOR DGAL/SDHA/N93 USDA/FSIS Microbiology laboratory Guidebook 3rd Edition Canada Health and Welfare Canada MFHPB30 各省、市CDC和其他系统专家提出的修改意见
十单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012 吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法;第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品.本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。
本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。
本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下:2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃。
2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃。
2。
3 均质器。
2。
4 显微镜：10×～100×.2.5 电子天平：感量0。
1 g.2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL(具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0。
1 mL刻度)。
2。
8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2.10 离心管:30 mm×100 mm。
2.11 无菌注射器：1 mL.2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2。
13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2.14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB—YE）：见附录A中A.1。
3。
2 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA—YE）：见附录A中A。
单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则
单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则1、目的根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。
2、适用范围适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
3、职责检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。
4、试剂及器材4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株4.2 马红球菌4.3 小白鼠：16-18g4.4 TSB-YE4.5 TSA-YE4.6 EB增菌液4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）4.8 三糖铁琼脂4.9SIM动力培养基4.10 琼脂4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）4.12 硝酸盐培养基4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水4.14 糖发酵培养基4.15 过氧化氢4.16 1%盐酸丫啶黄溶液4.17 1%萘啶酮酸盐溶液5、仪器设备5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃5.2 恒温水浴锅：46±1℃5.3 离心机：4000r/min5.4 显微镜5.5 均质器6、检测步骤6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1增菌液中，充分搅拌成均质。
如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。
6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。
角斜光照射平板。
6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃。
一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。
6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。
单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项
单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项嘿，宝子们！今天咱们来聊聊单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项呀。
这可相当重要呢！**一、样本采集的注意事项呀**哎呀呀，样本采集可是第一步哇，这一步做不好，后面可就全乱套了呢！首先呢，采集样本的环境得合适吧？要是在那种脏兮兮、乱糟糟的环境里采集，很容易就把其他杂菌也带进来了呀。
比如说，从食品加工厂采集样本的时候，得确保采集的器具都是干净无菌的呢！哇，这一点千万不能马虎呀！还有哦，采集的样本量也要合适呢。
太少了的话，可能就检测不到这种狡猾的李斯特氏菌了呢。
那到底多少才合适呢？这就得根据具体的检测对象来定啦。
像是肉类食品，可能就需要采集足够多的量来保证能检测出潜在的病菌呀！**二、样本运输过程中的注意事项哟**样本采好了，就得运输到实验室去检测啦。
嘿，这运输的过程也有好多要注意的地方呢！温度是个大问题啊！单核细胞增生李斯特氏菌在不同温度下的存活状态不一样呢。
如果温度太高了，细菌可能会大量繁殖或者死亡，这都会影响检测结果的呀！所以，一定要确保运输过程中样本处于合适的温度环境下呢。
那怎么做到呢？哇，可以使用专门的保温箱呀，再加上合适的温度调节剂，像是冰袋或者暖宝宝（如果是需要低温的情况就用冰袋，需要一定温度的情况就用暖宝宝之类的东西啦）。
还有呀，运输过程中要避免样本受到剧烈的震动或者碰撞呢。
要是把样本晃得七荤八素的，细菌的状态可能就改变了呢，这检测结果还能准吗？**三、实验室检测时的注意事项哇**到了实验室啦，这里更是要小心谨慎呢！首先，检测人员得做好自身的防护工作呀。
毕竟李斯特氏菌可是可能对人有危害的呢。
要穿上合适的防护服、戴上手套和口罩哦。
哎呀呀，这可不能嫌麻烦呢！然后呢，在进行检测操作的时候，仪器设备得提前校准呀。
如果仪器不准，那检测出来的结果能靠谱吗？肯定不行啦！在进行细菌的培养、分离等操作的时候，培养基的选择和配制可重要了呢。
要选择适合单核细胞增生李斯特氏菌生长的培养基呀，而且配制的时候各种成分的比例一定要准确无误呢。
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V
＋＋Βιβλιοθήκη 伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii) (绵羊)
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英诺克李斯特氏菌
(L.innocua) (无害)
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V
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注：＋阳性；－阴性；V反应不定。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h，李斯特菌 有动力，呈伞状生长。
H2O(二馏灭菌水) 12.8μl，
10×buffer2.0μl，
Mg2+(25mol/l) 2.0μl， 4×dNTP(10mmol/ml) 1.6μl， Primer(30pmol/μl) 各0.25μl，
Taq E（2.5U/μl）0.1μl
DNA(20-30ng/μl )1.0μl；
增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）对
小鼠有致病性。
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型。虽然Lm有16种血清型，1/2a、 1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、 4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7，但只 有3种血清型 (1/2a、1/2b、4b)可引起疾 病。从食品和患者中分离的菌株95％以上 是1/2a，1/2b，1/2c和4b等血清型，而 3a、3b、3c、4a、4c、4e、4d和7等血 清型在食品中非常少见，也没有引起李斯 特菌病的报道。
溶血实验：
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格 ，从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每 格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李 斯特菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克 李斯特菌)，
于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底 部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产 生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无溶 血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血环 。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌 ，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来 确证李斯特氏各种菌。
溶血增强。
金葡
伊氏李
马红
单核
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中 , 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液，用0.85
无菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/mL的菌悬液
, 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 3～5只, 每只 0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞
接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h
木糖-，鼠李糖+ 鉴定
结果报告
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于 30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入 10mL LB2增菌液中二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选 择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板 上，于37℃培养24 h，观察各个平板 上生长的菌落,各个平板上的菌落特征 见表1。
协同溶血试验 (cAMP):
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌
(R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特
菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查 平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色 葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血
增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
葡萄糖
塔格糖
单增李斯特菌编码:
2410、2510、2550、6010、6110、 6150、6410、6450、6510
VITEK
采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异 性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血 素基因(hlyA)，并评价该方法的特异性 与敏感性。 结果 在706bp处出现nuc 基因的目的片断，只有单增李氏菌的 目的片段获得扩增其它菌种扩增均呈 阴性；该方法可以检测到3.3pg/μl的 DNA。
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物 中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状 ，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些 细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性 厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛 ，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动 消失。
1.初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新
的分类学研究表明，其分为六个种：
单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
API10300
L.M的API10300鉴定结果
试验
DIM ESC MAN DAPL XYL RHA MDG RIB GIP TAG
有效成分 反应/酶
酶底物
结果 -
浅橙色浅褐色灰褐色
结果 +
橙色
七叶灵水 解
甘露糖苷 酶
阿拉伯糖
浅黄色 无色 红色/橙红色
木糖
黑色
黄色
黄色/橙黄 色
鼠李糖
葡萄糖苷
核糖
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
37℃24h－48h， 30℃24h－ 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
37℃18h-24h, 蓝色菌落周围 呈白色晕圈
菌种
单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes)
溶血反应 ＋
协同溶血 葡萄糖
＋
＋
麦芽糖 ＋
MR-VP ＋/＋
甘露醇 －
鼠李糖 ＋
木糖 －
七叶苷 ＋
格氏李斯特氏菌 (L.grayi)
斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)
－
－
＋
＋
＋/＋
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri)
引物 针对单核细胞增生李斯特氏菌溶血 素基因（hlyA）设计引物，委托上海生 物工程技术服务有限公司合成。单核细 胞增生李斯特氏菌特异性引物序列如下 ：
上游（F）：
5´-GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC— 3´
下游（R）：
5´--
PCR检测方法：（1）取1ml被检样李斯 特氏菌增菌肉汤用于提取DNA的，模板 DNA的制备， 根据试剂盒说明书进行 ；（2）PCR反应体系：20μl 。
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册
1.定性检测 2.定量检测
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h 0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基
PALCAM琼脂
36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
L.M在PALCAM培养基生长特征
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很 难与杂菌区分
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易 与杂菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分 ，对高污染食品中的杂菌抑制性较差
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片 检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为 0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制 成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌 出现轻微旋转或翻滚样的运动。
谢谢！！！
知识回顾Knowledge Review
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典 型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李 糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰 酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上 划线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖 阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在 TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核 增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动 物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类 的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌 中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主 要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。