单核细胞增生李斯特菌检验

单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后 主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界 中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污 染。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人 类健康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
MMA 30℃48h菌落 针尖大小、形 态不典型，与 杂菌难区分抑 制性强
PALCAM
OXA
CHROMagar
37℃24h－48h， 30℃24h－ 37℃18h-24h, 2mm灰绿色中 48h,2mm灰黑 蓝色菌落周围 心黑色凹陷， 色菌落周围呈 呈白色晕圈 菌落周围呈棕 棕黑色水解圈 黑色水解圈
按2009年国家食源性疾病检测网的工作手 册 1.定性检测 2.定量检测
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h
0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h
科玛嘉李斯特菌显色培养基 36 ℃±1 ℃，24 h～48 h
PALCAM琼脂
协同溶血试验 (cAMP): 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯 特菌, 但不要触及它们, 于30℃培养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金 黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的 溶血增强, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血 也增强, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在马红 球菌附近的溶血增强。
API10300
L.M的API10300鉴定结果
试验
有效成分 反应/酶 酶底物 七叶灵水 解
结果 浅橙色浅褐色灰褐色 浅黄色
结果 + 橙色 黑色
DIM ESC
MAN
DAPL
甘露糖苷 酶
阿拉伯糖
无色
红色/橙红色
黄色
黄色/橙黄 色
XYL
RHA
木糖
鼠李糖
MDG
RIB GIP TAG
葡萄糖苷
核糖 葡萄糖 塔格糖
接种木糖、鼠李糖， 36 ℃±1 ℃ ， 24 h ；同时于 TSA-YE 平板划线纯化， 30 ℃±1 ℃，24 h～48 h
木糖-，鼠李糖+
鉴定
结果报告
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于 30℃培养24h, 吸取0.1 mL，加入 10mL LB2增菌液中二次增菌。 分离培养:LB2 二次增菌液转种于选 择培养基PALCAM和科玛嘉琼脂平板 上，于37℃培养24 h，观察各个平板 上生长的菌落,各个平板上的菌落特征 见表1。

一方面血清是进口的，无国产的；另一 方面只存在“O”抗原因子血清，并且各 型之间含有多种共同的抗原因子，因此 其血清学上鉴别意义不大。
2.商业生化鉴定系统的应用 原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用 API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这些方法都比较成熟，稳定性 较好，已被许多国家和组织的标准采用。 我国许多单位也积累了较多的经验，使用 最广泛的是API 10300, Vitek GNI， 考虑到各种系统在国内的实际应用现状， 拟定在生化鉴定方面“采纳API10300或 Vitek GNI为传统生化鉴定方法的选择性 替代方法”。

血清学分型: Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清学 分型。虽然Lm有16种血清型，1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c 、4d、4e、5、6a、6b和7，但只有3种血 清型 (1/2a、1/2b、4b)可引起疾病。从 食品和患者中分离的菌株95％以上是1/2a ，1/2b，1/2c和4b等血清型，而3a、3b、 3c、4a、4c、4e、4d和7等血清型在食品 中非常少见，也没有引起李斯特菌病的报 道。




PCR检测方法：（1）取1ml被检样李斯特 氏菌增菌肉汤用于提取DNA的，模板DNA 的制备， 根据试剂盒说明书进行；（2 ）PCR反应体系：20μl 。 H2O(二馏灭菌水) 12.8μl， 10×buffer2.0μl， Mg2+(25mol/l) 2.0μl， 4×dNTP(10mmol/ml) 1.6μl， Primer(30pmol/μl) 各0.25μl， Taq E（2.5U/μl）0.1μl DNA(20-30ng/μl )1.0μl；

该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物 中呈短小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状 ，在老龄培养物中呈长丝的长杆菌状，有些 细菌因此而变成革兰氏阴性；为需氧或兼性 厌氧菌，在20～25℃培养时能形成4根鞭毛 ，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛，运动消 失。
1.初筛 在我们前期工作中发现，高污染样品在选 择性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检 和减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或 可疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无 须烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
金葡
伊氏李
马红
单核


对小鼠的毒力试验 （可选择） 将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE 中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液，用 0.85无菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/mL的 菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 3～5只 , 每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2 ～5d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核 细胞增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（ L.ivanovii）对小鼠有致病性。
谢谢！！！

于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接近底 部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单 增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围 产生狭小的透明溶血环，无害李斯特菌无 溶血环，伊氏利斯特菌产生大的透明溶血 环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种 菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来 确证李斯特氏各种菌。
单增李斯特菌编码: 2410、2510、2550、6010、6110、6150、 6410、6450、6510
VITEK

采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异 性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血 素基因(hlyA)，并评价该方法的特异 性与敏感性。 结果 在706bp处出现 nuc基因的目的片断，只有单增李氏菌 的目的片段获得扩增其它菌种扩增均 呈阴性；该方法可以检测到3.3pg/μl 的DNA。


引物 针对单核细胞增生李斯特氏菌溶 血素基因（hlyA）设计引物，委托上海 生物工程技术服务有限公司合成。单核 细胞增生李斯特氏菌特异性引物序列如 下： 上游（F）： 5´--GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC—3´ 下游（R）： 5´--CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC--3´



表1 单核细胞增生李斯特菌在选择性平板 上的菌落特征 选择性琼脂平板单核细胞增生李斯特菌科 玛嘉显色培养基菌落为:蓝色，周围有白色 晕圈. PALCAM琼脂菌落:为灰绿色，小的圆形菌落 ，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色 凹陷
L.M在 Chromagar培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
L.M在PALCAM培养基生长特征
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难 与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与 杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差

染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片 检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小 为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水 制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
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V
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伊氏李斯特氏菌 (L.ivanovii) (绵羊) 英诺克李斯特氏菌 (L.innocua) (无害)
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＋
＋
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＋/＋
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V
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注：＋阳性；－阴性；V反应不定。



动力试验 将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中，于30℃培养24h-48h，李斯特菌有动 力，呈伞状生长。 溶血实验： 将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格， 从TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺 种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特 菌和绵羊李斯特菌)和阴性对照菌(英诺克李斯 特菌)，


（3）扩增条件：预变性94℃ 5min， 变性95℃60s退火 63℃ 60s ，延伸 72℃ 60s 30个循环，再延伸 72℃8min，20℃ pause。 （4）结果观察：PCR产物用1.5％琼脂 糖凝胶，100v电压电泳，溴化乙锭 (EB)染色，凝胶成像分析仪中观察扩 增结果，扩增片段长度为706bp。
菌种 单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes)
溶血反应
协同溶血
＋
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
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格氏李斯特氏菌 (L.grayi) 斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)
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威氏李斯特氏菌 (L.w分别挑取5个以上典 型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李 糖发酵管，于37℃培养24h；同时在胰酪 胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）平板上划 线纯化，于30℃培养24h-48h。木糖阴性 为蓝色，鼠李糖阳性为黄色，在TSA-YE 平板上可疑菌落为淡蓝色。
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验
李斯特氏菌属



李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中 ，最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌： 单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其 他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和 人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯 特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。