单核细胞增生李斯特菌检验

允许使用经过确 认的商业化生产 的单核增生李斯 特氏菌菌株鉴定 试验，但没列明 具体试剂盒名称
检测程序
目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌 肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉汤 （FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB （Listeria enrichment broth）和BLEB （buffered Listeria enrichment broth）
半量Fraser ISO 肉汤 11290（30℃， 1:1996（E） （ ） 24±2h）
OXA和 PALCAM Fraser肉汤 （30、35或37℃， （35或37℃， 24-48h，） 48±2h） PALCAM平板微 需氧或好氧条件 培养
蓝色菌落*；过氧化氢酶；革 兰氏染色；动力试验或典型 运动*；溶血试验；糖发酵试 验；协同溶血；送参考实验 室（血清或噬菌体分型）
选择性增菌肉汤的比较和筛选
通过对高污染及低污染食品进行增菌效 果比对，结果表明： LB肉汤的增菌效果 最佳 BLEB更适于背景微生物较少的熟食样品 修订标准选择LB增菌肉汤
分离培养基的比较和筛选
方法 原国标 AFNOR FDA USDA Health Welfare Canada 培养基 MMA OXA、PALCAM MMA、OXA、LPM MOX PALCAM、OXA
修订原则
参照FDA、AOAC、ISO、 AFNOR等有 关标准，使本标准更接近现行国际标准 保持与原标准的连续性
修订依据
FDA BAM (2001) chapter10 AOAC 975.55 987.09 ISO11290-1 AFNOR DGAL/SDHA/N93 USDA/FSIS Microbiology laboratory Guidebook 3rd Edition Canada Health and Welfare Canada MFHPB30 各省、市CDC和其他系统专家提出的修改意见
结果报告
单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
菌种 溶血反 应 协同溶 血 ＋（金 葡） － ＋（金 葡） 葡萄 糖 ＋ ＋ ＋ 麦芽 糖 ＋ ＋ ＋ MRVP ＋/＋ ＋/＋ ＋/＋ 甘露 醇 － ＋ － 鼠李 糖 ＋ － － 木糖 － － ＋ 七叶 苷 ＋ ＋ ＋
单核细胞增生李 ＋（狭 斯特氏菌 窄） (L.monocytogenes) 格氏李斯特氏菌 － (L.grayi) 斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri) 威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri) 伊氏李斯特氏菌 (L.ivanovii) 英诺克李斯特氏 菌(L.innocua) ＋
无
GB/T 4789.302003
EB （30±1℃，48h） LB1 （30±1℃， 24h） LB2 （30±1℃， 24h）
蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色 镜检（革兰氏染色、典型运动）；生 MMA 化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿 （30±1℃，24-48h） 素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力 试验；协同溶血 OXA/PALCAM/MO X/LPM+七叶灵 +Fe3+ 推荐BCM /ALOA / RapidL'mono /CHROMagar Listeria
UVM
UVM只有选择性没有区别性 加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因 子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添加柠 檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。
LEB和BLEB
只有选择性没有区别性 LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、 萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入 的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不 含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸 二氢钾和磷酸氢二钠
PALCAM
OXA
CHROMagar
37℃24h－ 30℃24h－ 37℃18h-24h, 48h，2mm灰 48h,2mm灰 蓝色菌落周围 绿色,有的菌落 黑色菌落周围 呈白色晕圈 中心黑色凹陷；呈棕黑色水解 菌落周围呈棕 圈 黑色水解圈
L.M在OXA培养基生长特征
L.M在PALCAM培养基生长特征
半量Fraser肉汤和Fraser肉汤
具有选择性和区别性。 加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特 氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使 培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是 否有单核李斯特氏菌的生长。 氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。 半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样 半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/L Fraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/L
检测程序 ---分离
分离培养基有：OXA、PALCAM、LPM、MOX等， 但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特 氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养 基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色 反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈。 还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、 CHROMagar listeria、Rapid’L. mono等。
方法名称 加 工
一次增菌 MBP 30℃，1824h
二次增菌 EB 30℃，24/48h
分离
鉴定
快速方法
SN 0184 1993
未 加 工
EB （30℃，24/48h）
MMA/ OXA （35℃，24-48h）
蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶； 革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验； 硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发 酵；动力试验；协同溶血*；血清学 检验*；小鼠毒力试验*
食品中单核细胞增生李斯特氏菌 检验
国标修订协作组 中国CDC营养与食品安全所
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的 分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核 增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动 物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类 的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中 最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。
－
－
＋
＋
＋/＋
－
V
＋
＋
＋（马 ＋（较 红球菌） 大） － －
＋
＋
＋/＋
－
－
＋
＋
＋
＋
＋/＋
－
V
－
＋
注：＋阳性；－阴性；V反应不定。
初筛 高污染样品在选择性琼脂平板上可 疑菌落较多，为避免漏检和减少工作量， 增加初筛步骤：挑取典型或可疑菌落接 种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须烧环 同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
比对试验： 1. MMA 2. 进口OXA 3. 进口PALCAM 4. 国产OXA 5. 国产PALCAM 6. CHROMagar
高污染食品及低污染食品的分离效果 比较 农贸市场生肉、熟肉样品 超市生肉样品 回收率比较
MMA 30℃48h菌 落针尖大小、 形态不典型， 与杂菌难区 分抑制性强
修订内容
单增李斯特氏菌选择性增菌肉汤的比较 和筛选 单增李斯特氏菌选择性培养基的比较和 筛选 初筛步骤
选择性增菌肉汤的比较和筛选
方法 FDA USDA 国内ISO 国内SN 原国标 培养基 BLEB Fraser ISO Fraser SN Fraser EB 和LB
根据各省反馈 意见及长期使 用经验，EB增 菌液增菌效果 远远低于LB增 菌液
无
NMKL No.136 2nd 1999
LBⅠ （30.0±1. 0℃， 24±3h）
LBⅡ OXA和 溶血试验；过氧化氢酶；革 （30.0±1.0℃， PALCAM 兰氏染色；典型运动 24±3h）或 （37.0±1.0℃， 动力试验；糖发酵试验；送 Fraser肉汤 24±3/48±4h， 参考实验室（血清、噬菌体、 （37.0±1.0℃， DNA或酶分型） 好氧或微需氧） 48±4h）
L.M在 Chromagar培养基生长特征
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很 难与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易 与杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分， 对高污染食品中的杂菌抑制性较差
回收率： 进口PALCAM和CHROMagar较高，结果 稳定
进口PALCAM和科玛嘉均优于进口OXA、 国产PALCAM、国产OXA和MMA。背景 微生物较少时，科玛嘉的分离效果最好； 背景微生物较复杂时，进口PALCAM分 离效果最好 根据各省长期使用经验及本次实验结果 结合参考文献，修订标准拟采用 PALCAM和CHROMagar分离培养基
由于在李斯特氏菌属中，只有单增李斯特 氏菌与英诺克李斯特菌的木糖与鼠李糖 发酵结果相同，即木糖阴性为蓝色，鼠 李糖阳性为黄色。在TSA-YE平板上可疑 菌落为淡蓝色或蓝灰色。对木糖、鼠李 糖典型反应的菌落，可直接从TSA-YE平 板上挑取进行进一步的实验
2.商业生化鉴定系统的应用 原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GPI（AOAC 989.13），这些方 法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和 组织的标准采用。 我国许多单位也积累了较多的经验，使用 最广泛的是API 10300, Vitek GPI，考虑到各 种系统在国内的实际应用现状，拟定在生化鉴 定方面“采纳API10300或Vitek GPI为传统生 化鉴定方法的选择性替代方法”。
方法名称
一次增菌
二次增菌分离Fra bibliotek鉴定快速方法
CFIA MFHPB30
LEB （UVM） （30℃， 24/48h）
MFB （35℃，2448h）
OXA+LPM或 MOX或 PALCAM
作为鉴定的可选 典型运动或动力试验；溶血 步骤，允许使用 试验；甘露醇；木糖；鼠李 快速方法，如 糖；快速鉴定试剂盒*；过氧 Vitek或API、 化氢酶*；革兰氏染色*；协 Micro ID Listeria、 Listera 同溶血*；血清学试验* Accuprobe™
检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质
30 ℃±1 ℃，24 h
0.1 mL+10 mL LB2增菌液
30 ℃±1 ℃，18 h～24 h 科玛嘉李斯特菌显色培养基 PALCAM琼脂
36 ℃±1 ℃，24 h～48 h 接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同 时于TSA-YE平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h 木糖-，鼠李糖+ 鉴定 染色、动力、H2O2酶、糖 发酵、MR-VP、溶血（格 子穿刺，底部）、协同溶血
FB （35±2℃， 26-48±2h）
MOX （35±2℃，2648±2h）
筛选用的快速方法必 初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动； 须经过确认后才可使 生化鉴定：MICRO-ID® Listeria或 用 Api® Listeria或BAM等方法中的传统 鉴定中用到MICRO生化反应；协同溶血 ID® 、Api®、 遗传鉴定：核糖体RNA检测；PFGE* GenProbe AccuProbe®、 GENE-TRAK®
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要 表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例， 死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。
无
FDA
BLEB+Phy （30℃，4h）
BLEB+Phy+ 三种抑菌剂 （30℃， 20/44h）
蓝色菌落*；典型运动或动力试验； 过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验； 筛选、鉴定都可以使 硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血； 用快速方法 血清学检验；小鼠毒力试验*
USDA
UVM （30±2℃， 22±2h）