65-人巨细胞病毒核酸检测标准操作程序

人巨细胞病毒核酸定量核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。

2.应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）和PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、ABI Prism 7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA 检测。

3.职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。

4.内容4.1 实验原理和临床应用本品选取人巨细胞病毒珠（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp,利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。

本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测，用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控，不用于血源筛查。

本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

4.2标本采集4.2.1 使用标本类型：尿液、乳汁、血清和淋巴细胞4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。

4.2.2.1 尿或乳汁：取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。

标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。

4.2.2.2 血清：用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管，4℃静置过夜。

吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5mlEppendoff管中，即为血清标本。

标本可立即用于测试（48小时以内），也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

4.2.2.3 淋巴细胞：取静脉血（EDTA抗凝）1ml,利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。

标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。

4.3 试剂准备4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。

4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。

4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。

4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。

4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。

4.5 操作过程说明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品处理：分别取出阴性、阳性质控品，8000rpm离心数秒，各吸50ul至1.5ml 灭菌离心管中，瞬时离心后95℃干浴2min，立即冰浴2-5min后13000 r/min离心1min，上清液用于PCR扩增。

4.5.1.2 样本处理4.5.1.2 样本处理4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000rpm离心5分钟，上清备用。

4.5.2 加样: 从4℃冰箱取出处理好的样本以及质控品转移至加样区，取上清液5ul加至PCR 反应管进行PCR扩增。

4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.3.1 打开计算机电源。

4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。

打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。

如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。

4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。

4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。

(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。

在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）。

4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。

4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard （标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。

对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。

方法为：点击，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。

也可以直接点击标准品的各个孔位，在一栏，手工输入浓度。

若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。

或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。

4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。

在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。

要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。

如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。

点击，导入以前设定的PCR程序。

（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。

可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。

若要去除，可将其拖出循环设定区域。

4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。

会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。

软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。

在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。

还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。

4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。

4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。

可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。

点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。

左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。

右边的可根据自己的需要选择显示的界面。

是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。

4.5.3.11分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing 对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。

4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。

4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。

点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。

4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。

在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。

4.5.3.15 分析质控结果：阴性质控品：GBS(FAM)Ct值= 40或“No Ct”，内参照（HEX）Ct值<40，且有较好的对数增长曲线。

阳性质控品：GBS（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增长曲线；内参照（Texas Red）Ct值≤40。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。

4.5.3.16 记录实验数据。

4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。

4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。

4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。

4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。

4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：。

4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。

4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。

4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。

4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。

4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。