菌种培养基

三、按培养基用途分为：基础培养基、选择性培养基、
加富培养基、鉴别培养基
四、按生产用途（从发酵生产应用考虑）
培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养 基和发酵培养基三种。
孢子培养基
要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量好，且不会
引起菌种变异。
特点 C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子； 无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子
理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进
行物料衡算，所得出的转化率的大小。
实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个 目标
例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如 下： 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为： C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
例：谷氨酸发酵
有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐
② 淀粉、糊精
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类 缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应
四个原则
物理化学条件适宜 经济节约 生态模拟 查阅文献
四种方法
精心设计 试验比较
一、培养基成分选择的原则
菌种的同化能力 代谢的阻遏和诱导 合适的C、N比
100∶0.2～2.0
pH的要求
培养基的设计

了解菌种菌种名称、营养、生活史、生长环境、生理生化 特性

培养基种类的确定 营养类型：主要底物，降解特点 生长环境：温度、pH、渗透（无机盐）、耗氧情况 合成条件 天然替代品的确定及其预处理

发酵培养基的设计和优化
正交设计确定优化的配方

发酵培养基的设计和优化

发酵培养基的设计和优化
改进后培养基 原培养基
改进后培养基的发酵结果
四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方
摇瓶、反应器培养基研究的两个层次
摇瓶——培养基设计的第一步
反应器—最终的优化的基础配方

发酵培养基的设计和优化
例： 青霉素发酵
④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。
第一节 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型
一、按营养物质来源分为
合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产 天然培养基：采用天然原料 原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 半合成培养基：在天然培养基中加入一些化学药品补充无机 盐成分
满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH
2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。 例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
量。
种子培养基

要求
营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些； 培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子
发芽生长，保证球形；
pH要稳定；
最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发酵合成
期才大量需要的物质。
发酵培养基

目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量， 同时组分尽可能单一，以保证高的得率。 要求
发酵培养基的设计和优化
原培养基:

发酵培养基的设计和优化
初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)

发酵培养基的设计和优化
通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)
考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好

发酵培养基的设计和优化
结果： 碳源：乙酸钠 0. 2% 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03% 无机盐: 复合无机盐0.05%
么？

在应用天然C、N源时应注意什么问题？
一、碳源
1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需 的碳成分。 提供合成目的产物所必须的碳成分。 2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃
3、工业上常用的糖类
① 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖。 但是会引起葡萄糖效应。
工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的
质量指标。
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
② 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘 蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许 多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。

五、水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性 固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻。
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁 的水。
第三节 发酵培养基的设计和优化
青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间
例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）
转化率为：13.8/[(0.337/0.6)*36]=68%
用法：前体使用时普遍采用流加的方法。
前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利
2、前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸：分子பைடு நூலகம்136
作用：前体有助于提高产量和组份。 用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题。 例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸
营养丰富完全，有利于产物合成；

不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；
在产物分泌期间，pH 稳定； 加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；
采用中间补料，以提高发酵单位；
原料的考虑——成本问题
第二节 发酵培养基的成分及来源

培养基有哪些化学成分组成？这些成分的来源 有哪些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什
例：黑曲酶NRRL-330，生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
pH 4.25 5.45 4.62 酶活 120分钟 30分钟 75分钟
不加 加 K2HPO4 加 KH2PO4
四、生长因子、前体和产物促进剂
1、生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机 物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷 型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重 要的作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源 含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可 缺少的生长因子。
② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。

发酵培养基的设计和优化
类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化
郭秒,食品与工业发酵，2004
类胡萝卜素的作用：色素、营养保健

发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8%
轻质碳酸钙1%。 发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用
早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
有些产物会受氮源的诱导和阻遏
例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣
的课题
三、无机盐的微量元素
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸 性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸 性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢 后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如 硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义：
二、氮源
氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、 核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机 氮源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用 的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
二、按物理状态分为
固体培养基 ：适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应 用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。 半固体培养基：即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂， 一般用量为0.5%～0.8%，主要用于微生物的鉴定。 液体培养基：80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶 性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
第3章
菌种培养基
培养基
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用： 满足菌体的生长
促进产物的形成
发酵培养基的要求：
① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。
1、作用：各种不一样
2、来源：C、N源，以盐的形式补充
3、用量：根据具体的产品，以实验决定
4、使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理 B、使用时注意盐的形式（pH的变化）
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算 出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生
物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合
某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性， 采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计
和实验方法选择出较为适合的培养基。
目的明确 营养协调 以粗代精 以野代家 以废代好 以简代繁
葡萄糖转化为酒精的理论得率为：
Y = 2×46 /162 = 0.57
（二）、实验设计
培养基成分的含量最终都是通过实验获得的
合理的实验方法
多因子实验
多因子实验：均匀设计、
正交实验设计、 响应面分析等。
三、培养基设计的步骤
① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑
的问题，初步确定可能的培养基成分；
苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率。
3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物， 又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方 面的。

有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。



菌代谢产物的化学结构、性质、途径；


培养基的设计（续）

基本培养基的确定

来源广泛、价廉； 适于生长、繁殖、产物积累； 不同阶段有不同的基本培养基； 用量的计算：C、N及前体。 单因子实验 正交实验 响应面分析方法




培养基的优化



二、成分含量的确定
（一）、理论转化率与实际转化率