纤维素酶活力的测定
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
β-糖苷酶活力的测定(CMC)
一目的:
掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理:
纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中分解出还原糖,还原糖又同3,5-而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。
二试剂:
1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂):称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,200g酒石酸钾钠,加税500ml,升温溶解后,加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000ml。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。
2.L 醋酸-醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(H2O),醋酸(CH3COOH),用蒸馏水溶解,并定容至1000 ml,配好后用pH计矫正。
3.1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取100mg分析纯葡萄糖(预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ml,冰箱中保存备用。
4.代测酶液:称取酶粉(或吸取酶液),先用少量的L 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研3-4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,40℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱脂棉过滤,滤液供测定用。
5.底物:%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区羧甲基纤维素钠(Sigma公司生产),准确至,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。
三仪器:
分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤:
1.标准曲线的绘制
分别吸取, , , , , , 的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中,分别用蒸
馏水补充体积至,各加3,5-而硝基水杨酸,在沸水浴中煮沸5min,冷却后
分别用蒸馏水定容至20ml,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液,按上述同样
操作为空白调零,在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体
积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出
标准曲线(理论上此线应过原点)。
取20ml比色管1支,加入L 醋酸-醋酸钠缓冲液和6小片1cm×1cm滤纸后,再加适当稀释的酶液,于40℃下保温1h后,再加适当稀释的酶液,于40℃下保温1h后,加DNS液,在沸水煮沸5min显色,流水冷却,用蒸馏水定容至20ml,摇匀;另取一支试管,加缓冲液和滤纸后,先加DNS液,再加缓冲液,同样显色、冷却、定容作为空白,在波长540nm比色,测定A值,查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W。
五计算
酶的比活力定义:在40℃,条件下,每小时催化滤纸产生相当于1ug分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位,以U/g表示。
W×1000×n
X = -----------
×180×30
式中,X----样品酶的活力,U/g(ug/ml);
W----查标准曲线得出相应的葡萄糖含量,mg;
1000----mg换算成ug的换算系数;
吸取酶液的量,ml;
180----葡萄糖分子量;
n----稀释倍数;
30----反应时间,min。