包被细胞培养板的相关问题---精品资料

培养板的包被及相关问题：为了适应不同的实验需要，可对培养板用不同的物质进行包被后使用，这其中有促进细胞黏附的，也有用于一些特殊检测需要的。不同的实验目的可能具体的方案亦不同，根据需要灵活掌握。

(一)多聚赖氨酸包被：

问：我要培养原代神经细胞培养，要用多聚赖氨酸铺细胞培养板，请问赖氨酸液怎么配，怎样铺扳子

答：配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效过滤200ml。

铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。

首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。

取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。

最后将铺好的板子放于培养箱待用。

如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。

问：PLL的分子量有3-5万，7-15万，15-30万几种，应怎样选择？？谢谢：）

答：我们养神经细胞，用的是分子量3万到7万的pll 。

以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。使用时，用高纯度的蒸馏水稀释成0.11mg/ml的使用浓度，过滤除菌，以50微升每平方厘米的量均匀涂于培养底物的表面，室温下静置5min，吸除多余液体，股风吹干即可。

问：多聚赖氨酸包被培养板后看上去应该是什么样的？？

要做原代培养，为了促进细胞贴壁，拟用PLL包被培养板。

1.我买的是博士德分装Sigma的10ml的那种，可是院子里搜了一下，有人说没有做过细胞培养试验，不确定能否用于细胞培养！！这怎么办，不能用么？

2.我的方法是这样的，取了0。5ml，加入5毫升灭菌去离子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（准备以后做免疫组化直接取片子的），一个孔一份，室温5分钟后吸掉液体，超净台内吹干过夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外线照一会儿再用。请问这样做有没有硬伤？？

3.包被好后的板底及玻片应该是什么样的呢？？我发现板子干了以后，上面有些白点点，一开始以为是水滴，后来发现不是。莫非是PLL，那也是不是太夸张了？？请问这种现象正常否？？

PDL有用于组化玻片包被的不能用于细胞培养，你在用前需先确定是细胞培养级的，细胞培养板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有颗粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下说明书。

我包被完用无菌水洗板子2－3次，吹干后很干净，以前用PBS洗，吹干后也发现有白点，考虑是PBS中的盐沉淀。

(二)明胶包被：

问：在细胞原代培养时，在培养瓶里铺明胶，国产的明胶也以可用吗？它是用什么配置呢？还有怎么消毒明胶呢？请多指教，谢谢！

答：国产明胶不太好用，明胶可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分钟，趁热分装，分装后放在4度，不要冰冻。

问：明胶消毒之后可以放置多长时间？还是现配现用呢？你说的分装是指直接铺在培养瓶吗？如果不是的话，放在4度冰箱不是已经固定了吗？固定之后有怎么铺在培养瓶呢？因为是没做过实验所以很不明白。

答：sigma 有现成的终浓度是2%的明胶，已消毒，买来即可使用，方便而且不贵，仅100多块钱。4度时明胶是胶冻状，室温下放置20-30分钟就可变成液态，说明书上建议使用的包被密度是5-10ug/cm2。

国产明胶就可以的，用去离子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用时取你所需量高压灭菌即可。灭菌结束取出稍凉就可以铺在培养瓶中。

问：明胶包板完毕后，培养皿要干燥呢还是保持湿润？

答：明胶包被培养板或培养瓶24小时后，将明胶倒掉，用培养基冲洗，就可以接种细胞了。

问：在园里搜索了一下关于明胶在细胞培养中的使用问题，还是有很多问题大家没有详细和标准的说明，现有几个具体问题，请教各位战友，

1.明胶溶液配置的问题:用无菌PBS配还是用去离子水配?我们实验室有国产的明胶，很大一瓶的那种，能不能用于细胞培养?难道一定要用GIBCO 20ML即用型的?

2.明胶使用浓度的问题:有说0.1%，1%和2%的，我养的是内皮细胞，应该用哪种浓度呢?

3.明胶消毒的问题:有人说可以高温高压灭菌，有人说应该要过滤。。。还有人说要先高压再乘热过滤?不会吧，到底要怎样?晕啊~~~

4.明胶包被培养瓶的问题:有人说包被后置培养箱过夜，用时在弃溶掉的，加PBS和培养液冲洗。。也有人说包被后吹干30min-60min 。再加培养液冲洗即可用，到底怎么个做法啊

5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题:包被后的培养瓶能够用多久呢?有文献说包被7天，干2-3天后放4度保存可以在两周内使用。

答：Q1.明胶溶液配置的问题

A1: 用去离子水来配即可。国产的行不行要去试验，保险的就是买进口的。其实通常是买Sigma的gelatin粉末来配就好了，不用买配好现成的。配好的浓缩液可分装放-20度长期保存，即将要用的浓缩液可放4度来备用。

Q2.明胶使用浓度的问题

A2:1%是浓缩母液的浓度，使用前才取适量稀释成0.1%来包被。

Q3.明胶消毒的问题:

A3: Gelatin是用高温高压灭菌的，其他你所说的方法也不是不能用，只是没必要。

Q4.明胶包被培养瓶的问题

A4:通常是包被1小時就够了，然后吸干，不需要清洗。因为你配gelatin溶液中并没含其他有害的物质，沖洗只是多了一道没必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。

Q5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题

A5.这个我不知道，但基本上是越快使用越好。由於包被的过程很快，所以我都是当天包被，在等的过程中可以去做其他的事，包被即将完成的前20分钟就开始处理細胞，等细胞收下来包被也就做好了，马上就用。

0.1%的明胶适合大多数细胞培养时的包被，在四度放置不会出现凝胶状。我参考的文献说内皮细胞用1％的明胶包被，也就是母液，它在四度放置时会适度凝结。我的内皮细胞用1％的明胶包被效果我觉得还不错。

不管你用包被1小时的方法还是包被4小时的方法，都最好从包被开始到使用的间隔不超过一天，包被的容器放置时间越长越不好。