固相合成基础 SPPS
多肽合成反应
多肽是少于100个氨基酸脱水缩合形成的化合物，分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，具有很高的生物活性。
随着多肽在药物研发、食品研究以及在化妆品领域的广泛应用（特别是生物制药的发展），多肽合成已然成为化学生物学研究的一个重要且不断增长的领域。
多肽合成反应1）末端氨基酸N端脱保护2）激活待添加氨基酸（C端脱保护）3）偶联成具有酰胺功能的肽4）重复上述步骤添加更多的氨基酸，直到得到目的肽多肽化学合成方法1）固相合成（SPPS）：在聚合珠或树脂上从C端（羧基端）向N端（氨基端）固相合成多肽。
*Boc多肽合成法经典的多肽固相合成法，以Boc作为氨基酸α-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc的脱除通常采用三氟乙酸(TFA)进行。
多肽合成时将已用Boc保护好的N-α-氨基酸共价交联到树脂上，TFA切除Boc保护基，N 端用弱碱中和。
肽链的延长通过二环己基碳二亚胺(DCC)活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。
在Boc多肽合成法中，为了便于下一步的多肽合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等。
FMOC-苯甘氨酸102410-65-1BOC-L-4-甲基苯丙氨酸80102-26-7BOC-L-羟脯氨酸13726-69-7*Cbz-氨基酸及衍生物CBZ-L-赖氨酸甲酯盐酸盐27894-50-42）偶联试剂：*活性酯/添加剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐106627-54-71H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐128625-52-5Fmoc-His(Trt)-Wang resin 100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.8mmol/g。
固相合成原理
溶剂
DCM：二氯甲烷 （Dichloromethane） MW：84.94；密度：1.33g/ml；熔点：－96.7℃；沸点：39.8℃ 作用：溶胀树脂、洗涤树脂MeOH：甲醇（Methanol） MW：32.04；密度：0.79g/ml； 熔点：－93.9℃；沸点：64.8℃ 作用：收缩树脂、洗涤树脂DMF ：N,N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethyformamideL） MW：73.1；密度：0.94g/ml； 熔点：－61℃；沸点：152.8℃ 作用：良好溶剂、溶胀树脂、洗涤树脂
do
something
二、多肽固相合成基本原理
按氨基酸顺序，定向形成肽键，得到目标分子；C末端的氨基酸固定在树脂上，反应， 过滤洗涤，切割；主要介绍Fmoc策略（α氨基保护基团为Fmoc）
脱保护
Fmoc：9－芴甲氧羰基（Fluorenylmethoxycarbonyl）MW：223.254PiP：哌啶、六氢吡啶（Piperidine）MW：85.15；密度：0.86g/ml；熔点：－7℃；沸点：106℃
பைடு நூலகம்
缩合试剂
HBTU NMM HATU苯并三氮唑-N，N， N-甲基吗啡啉 2-(7-偶氮苯并三氮唑)N’，N’，-四甲基脲 -N，N，N’，N’-四甲基六氟磷酸酯 脲六氟磷酸酯
MW：126.2 MW：135.1密度：0.8
缩合原理
HATU/HBTU法
DIC/DCC法
缩合终点的判断
茚三酮检测（定性）四氯苯醌检测（定性）取代度测定（定量）
提高缩合效率的方法
增加氨基酸投量延长反应时间提高反应温度更换反应液换用活性更高的缩合试剂更换反应溶剂（魔鬼溶剂）超声、微波
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多肽的固相合成_(经典版)
Diagram
•固相合成法的诞生
•多肽合成仪介绍
•活化基团Fmoc与tBoc
•多肽的不稳定
固相合成法的诞生
Max Bergmann 1932 Emil Fischer
有机化学家们
20世纪 50年代
1963
1902
1972 Lou Carpino
Merrifield
•到了 20世纪 50 年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包 • 1932 年， Max Bergmann 等人开始使用苄氧羰基 (Z) 来保护 α-氨基， 氨基， •到 1963 1972 年， Merrifield Lou Carpino 首次提出了固相多肽合成方法 首先将 9-芴甲氧羰基(FMOC) (SPPS) 用于保护 ，这个在多 α 括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也 •1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在 多肽合成才开始有了一定的发展。 其在碱性条件下可以迅速脱除， 10min就可以反应完全，而且由于其 肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅 取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论 多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢 反应条件温和，迅速得到广泛使用，以 BOC和FMOC这两种方法为基 速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革 基础。 命，并成为了一支独立的学科 ——固相有机合成(SPOS)。 础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完 善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合 成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
• 氨基及羧基保护 脱除 • 形成无保护的四 肽
• 缩合从N端延伸
多肽固相合成法
多肽固相合成法多肽固相合成法（Peptidesolid-phasesynthesis，简称SPS），又称为固相合成法，是一种特殊的分子生物学技术，它可以用于研究多肽结构、性质和功能的方法之一。
迄今为止，多肽固相合成方法已经成为最老的和最受欢迎的多肽合成方法。
因为它具有质量高、效率高、重现性好和经济性等优点，使得它在多肽和蛋白质合成之中占有重要地位。
多肽固相合成法一般由两个步骤组成：一是多肽合成本身，二是清洗和收率分离。
在多肽合成本身，使用一定的多肽合成试剂，及改变它们的环境和活性，使多肽按照从左往右的方向，连续构建出一个长链有机化合物。
在清洗和收率分离阶段，通过不同溶剂和改变酸碱度的方式，将多肽合成出物剥离，收集活性产物。
多肽固相合成有着很多的优点，使它成为多肽的生产技术的首选。
它可以有效地控制合成的多肽的质量，它是一种自动化的合成方法，具有高得多的重现性，且减少了许多人工操作，因而节约时间和金钱。
此外，多肽固相合成可以合成长度较大的多肽，从而为研究蛋白质结构提供有力支持；它可以有效地控制各种多肽的烷基化反应，从而制备出稳定性更好的多肽；多肽固相合成也可用于在不同位置引入荧光分子，从而可以用于荧光定量的研究。
多肽固相合成的技术不断发展，有着很多的变种，如SPPS，FP-SPPS，SPPS家族，TPP-SPPS，特别是TPP-SPPS，它可以在不影响产物纯度的情况下，大幅度提高多肽合成速度，可以大大提高产量和纯度，因此TPP-SPPS技术被认为是当今最有前途的多肽固相合成技术。
同时，多肽固相合成技术也存在一些不足，例如合成多肽的速度过慢，合成长度较大的蛋白质衍生物质无法满足需求；在合成过程中，多肽的合成稳定性有限，会影响最终产物的质量；在纯度较低的情况下，普通的多肽固相合成可能会因为操作不当出现异常产物。
因此，多肽固相合成法作为一种生物学技术，应当更加系统地掌握，深入研究，以便更好地发挥它的作用，以满足当代多肽研究领域的发展需求。
多肽 固相 流程
多肽固相流程Solid-phase peptide synthesis (SPPS) is a powerful technique for the efficient and controlled assembly of peptides. 固相肽合成（SPPS）是一种高效而受控的肽链组装技术。
It involves the step-by-step addition of amino acids to a growing peptide chain attached to a solid support. 它涉及将氨基酸逐步添加到连接到固相支持体上的肽链中。
This method allows for the rapid generation of peptides with high purity and yield, making it an essential tool for peptide synthesis. 这种方法可快速生成高纯度和收率的肽，使其成为肽合成的重要工具。
One of the key advantages of solid-phase peptide synthesis is the ability to easily purify the peptide product. 固相肽合成的一个关键优势是易于纯化肽产物。
After completion of the synthesis, the peptide remains attached to the solid support, allowing for simple and efficient purification steps. 在合成完成后，肽仍附着在固相支持体上，从而实现简单而有效的纯化步骤。
This can include washing away impurities and side products, ultimately leading to a highly purified peptide. 这包括清洗杂质和副产物，最终导致高度纯化的肽。
多肽药生产合成
多肽药生产合成
多肽药物的生产合成涉及多个步骤，从确定氨基酸序列到最终产品的纯化。
以下是多肽药物生产合成的一般过程：
1. 序列设计：根据药物的治疗目标，科学家首先设计多肽的氨基酸序列。
这一步需要考虑多肽的生物活性、稳定性和溶解性。
2. 固相合成法（SPPS）：目前多肽药物的生产主要采用固相合成法。
在此方法中，每个氨基酸的羧基被连接到一个不溶性的树脂上，然后逐个添加其他氨基酸，形成肽链。
每一步都伴随着侧链的保护和脱保护反应，以防止不必要的副反应。
3. 洗涤和脱保护：在每次添加一个氨基酸之后，必须彻底清洗树脂以除去未反应的试剂和副产品。
在整条肽链组装完成后，进行脱保护反应，释放出合成的多肽。
4. 裂解和纯化：多肽从树脂上裂解下来后，通常需要进一步的纯化步骤，如高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳等技术，以确保产品的纯度和一致性。
5. 分析和表征：使用质谱、核磁共振（NMR）和氨基酸分析等技术对多肽的结构和组成进行详细分析和表征。
6. 冻干和包装：纯化后的多肽通常通过冻干的方式保存，以延长其稳定性。
然后按照适宜的剂量单位进行包装，准备作为药物产品销售。
7. 质量控制：在整个生产过程中，必须严格执行质量控制措施，以确保所有批次的多肽药物都符合规定的安全性、纯度和效力标准。
多肽药物的生产合成是一个精细和复杂的过程，要求高度专业的设备和技术。
由于多肽分子本身的多样性和复杂性，合成过程中可能遇到多种挑战，如序列复杂性、合成效率、多肽稳定性和成本控制等。
随着技术的进步，多肽药物的生产方法也在不断优化，以提高产量、降低成本并简化生产流程。
金斯瑞多肽合成方法
金斯瑞多肽合成方法
金斯瑞的多肽合成方法主要包括多肽液相合成技术和多肽固相合成技术。
多肽液相合成技术（Liquid Phase Peptide Synthesis, LPPS）是传统的多
肽合成方法，通常用于大规模多肽、聚合多肽和难度多肽的合成。
多肽固相合成技术（Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS）是目前通用的多肽合成方法。
不同于多肽液相合成方式，SPPS使用一个固相，如树脂作
为一个固相基质，很大程度上增强合成效率。
SPPS有两大显著的优势：树
脂可以保护羧基端氨基酸避免副反应；SPPS方式易于分离多肽产品。
另外，SPPS也允许高通量合成多肽。
以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取更准确的信息。
固相合成基础SPPS
一、多肽合成概论1．多肽化学合成概述：1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖.今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善.Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等.多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。
它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。
到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。
多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。
通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。
多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。
近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。
固相多肽合成树脂的特征和进展(1).
固相多肽合成树脂的特征和进展(1)摘要：讨论了固相多肽合成（SPPS）的基本原理，以及固相多肽合成树脂的特征和进展；着重讨论了聚苯乙烯-苯二乙烯树脂的性质。
关键词固相多肽合成（SPPS）树脂前言自从1963年MERRIFIELD发展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以来，经过不断的改进和完善，到今天这个方法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。
固相合成的主要设计思想是[1]：先将所要合成肽链的羟未端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂*相连，然后以此结合在固相载体*上氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基，并同过量的活化羟基组分反应接长肽链。
重复（缩合—洗涤—去保护—中和和洗涤—下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
将固相合成与其它技术分开来的唯一特征是固相载体。
Merrifield和Erickon 提出了一种有用的载体必须满足的普遍要求[2] ：它必须包含反应位点，以使肽链能连在这些位点上，并在以后除去；它还必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被（载体）束缚的肽链之间的相互作用。
虽然这些要求的限度还不是很清楚。
并不是所有的要求都很容易达到；而且这里还有一些矛盾。
在一个被液体介质自由渗透的轻度交联的胶状系统中，被缚肽链和溶解的试剂之间的不受阻碍的接触似乎可以很容易达到。
传统的聚苯乙烯（PS）树脂就是这种类型；另一方面，被缚肽链之间的相互作用可以在一个固体表面功能化的、刚性更强的系统中达到。
曾研究过表面功能化的硅，但它的容易可能很低。
在这些极端之间有许多实用的或潜在的固相系统，对它们有各种描述：爆米花、巨孔、巨网和接枝共聚物。
实际中发现简单的凝胶状树脂具有最好的综合性能[2]。
多肽固相合成法综述
多肽固相合成法综述【摘要】：多肽是人体中重要的生命活性物质，其化学合成有着非常重要的意义。
多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域的重要的研究方法之一，近年来，由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点而得到了很大的发展。
本文介绍了多肽固相合成法的诞生、原理、分类、过程以及前景展望。
【关键词】：多肽；固相合成1 概述多肽是生物体内的具有特定功能的生命活性物质，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的，其分子结构介于氨基酸与蛋白质之间。
目前，多肽的化学合成法有液相法和固相法两种。
固相合成法由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点在药物研发领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域表现出了显著的优越性并且在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。
2 多肽固相合成2.1诞生1963年，Merrifield首次提出了多肽固相合成法（SPPS）这个具有里程碑意义的合成方法，可以说它带来了多肽化学合成上的一次革命。
在这之前，大量科学家在多肽合成以及氨基酸保护方面取得了不少成绩，为多肽固相合成法的诞生提供了实验和理论基础。
60年代末，Merrifield发明了世界上第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶-具有124个氨基酸的核糖核酸酶。
1984年，Merrifield也因为在多肽固相合成领域的突出贡献获得了诺贝尔化学奖。
2.2原理将所要合成的肽链的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体（高分子树脂）相连接，再以结合在固相载体上的氨基酸的氨基作为合成起点，脱去氨基保护基并同过量的活化羧基反应以延长肽链，不断重复这个步骤，即缩合成肽-洗涤-脱保护-洗涤-缩合成肽，直到得到目的肽链。
最后，将肽链从树脂上裂解下来，进行氧化折叠、纯化、化学修饰等步骤得到所要的多肽。
2.3分类多肽固相合成法有两种：一是Merrifield所建立的Boc合成法，它是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc(叔丁氧羰基)为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。
肽链 c端氨基酸相连的树脂
肽链 c端氨基酸相连的树脂
C端氨基酸相连的树脂通常用于固相合成（Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS）中。
在SPPS中，C端氨基酸通过其羧基与固相树脂上的活性基团（通常是氯乙酰基或三氟乙酰基）发生酰化反应，从而将其连接到树脂上。
这种树脂通常是氯甲基苯基甲酸酯（chloromethylated polystyrene resin）或氯乙酰化的乙二醇二甲基丙烯酸酯树脂（2-chlorotrityl chloride resin）等。
这些树脂具有良好的亲水性和化学稳定性，能够有效地承载氨基酸，并且在反应条件下不会发生不可逆的分解。
通过在树脂上逐步合成肽链，最终可以得到目标肽序列。
此外，C端氨基酸相连的树脂在固相合成中起着至关重要的作用，因为它们能够提供一个固定的平台，使得合成过程更加高效，并且便于后续的反应和纯化步骤。
这种树脂还可以通过不同的功能化基团来调控肽链的合成和修饰，以满足不同肽类化合物的合成需求。
总的来说，C端氨基酸相连的树脂在固相合成中扮演着关键的角色，它们的选择和设计对于肽类化合物的合成具有重要的影响，
能够影响到合成的效率和纯度。
因此，对于特定肽链的合成，需要根据具体的合成需求和目标来选择合适的树脂类型和功能化策略。
多肽固相合成法操作
多肽固相合成法操作多肽固相合成法（solid-phase peptide synthesis, SPPS）是一种重要的生物化学方法，用于合成多肽。
它以固相载体为基础，通过逐步添加氨基酸单元来构建多肽链。
本文将介绍多肽固相合成法的基本原理、步骤和应用。
1. 基本原理多肽固相合成法利用固相载体作为反应基质，将第一个氨基酸单元与载体共价结合。
随后，通过反复重复以下步骤，逐一将氨基酸单元添加到多肽链上。
首先，氨基酸单元的保护基团被去除，使其暴露出反应活性的氨基和羧基。
然后，氨基酸单元与多肽链的C末端反应，形成酰肽键。
最后，已添加的氨基酸单元再次被保护，以防止其在后续的反应中发生意外的副反应。
通过重复这些步骤，可以逐渐扩展多肽链的长度，直到合成目标多肽。
2. 合成步骤多肽固相合成法的步骤如下：（1）固相载体的选择：常用的固相载体包括树脂、聚合物和硅胶。
载体的选择应根据合成目标和反应条件来确定。
（2）固定第一个氨基酸单元：将第一个氨基酸单元与固相载体上的活性基团（通常是羟基或氨基）共价结合，形成起始多肽链。
（3）逐步添加氨基酸单元：重复以下步骤，逐一将氨基酸单元添加到多肽链上：- 去保护基团：使用适当的试剂去除氨基酸单元的保护基团，使其暴露出反应活性的氨基和羧基。
- 反应形成酰肽键：将氨基酸单元与多肽链的C末端反应，形成酰肽键。
- 保护新添加的氨基酸单元：为防止其在后续反应中发生副反应，需要对新添加的氨基酸单元进行保护。
（4）多肽链的完整性测试：在合成结束后，需要对多肽链的完整性进行测试，以确保合成目标的多肽已经成功合成。
3. 应用多肽固相合成法在生物医学研究和药物开发中具有广泛的应用。
它可以用于合成天然多肽、合成突变多肽、合成活性肽和合成药物前体等。
通过调整合成方法和反应条件，可以合成具有特定结构和功能的多肽，用于研究生物活性、药理学和临床治疗。
总结：多肽固相合成法是一种重要的生物化学方法，用于合成多肽。
多肽固相合成耦合剂的选择
多肽固相合成耦合剂的选择英文回答：When it comes to choosing coupling reagents for solid-phase peptide synthesis (SPPS), there are several factors to consider. The coupling reagent plays a crucial role in facilitating the reaction between the amino acid building blocks and ensuring high yield and purity of the synthesized peptide. Here are some considerations and examples of commonly used coupling reagents:1. Activation method: Different coupling reagents utilize different activation methods to promote the reaction. Common activation methods include carbodiimide-based activation and phosphonium-based activation. For carbodiimide-based activation, the most widely used coupling reagent is N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), which activates the carboxyl group of the amino acid. Another popular coupling reagent is HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate), which utilizes phosphonium-based activation.2. Side reaction suppression: One of the challenges in peptide synthesis is the potential for side reactions, such as racemization or aggregation. The choice of coupling reagent can help minimize these side reactions. For example, HATU (2-(7-aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) is known for its ability to minimize racemization during coupling reactions.3. Solubility and compatibility: The coupling reagent should be soluble in the chosen solvent system and compatible with the resin and amino acid derivatives usedin SPPS. For example, PyBOP (benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) is widely used in SPPS due to its high solubility in common organic solvents and compatibility with various amino acid derivatives.4. Cost-effectiveness: The cost of the coupling reagent should also be taken into consideration. While somecoupling reagents may offer superior performance, they can be more expensive than alternatives. It is important to strike a balance between performance and cost-effectiveness.In summary, the choice of coupling reagent for SPPS depends on factors such as activation method, side reaction suppression, solubility and compatibility, and cost-effectiveness. Examples of commonly used coupling reagents include DIC, HBTU, HATU, and PyBOP. By considering these factors and selecting the appropriate coupling reagent, one can optimize the efficiency and success of solid-phase peptide synthesis.中文回答：在选择固相多肽合成（SPPS）的耦合剂时，有几个因素需要考虑。
SPPS-固相合成肽,蛋白实用PPT文档
Peptide acids
1% TFA
Peptide acids
2-Chlorotrityl chloride resin
Choose of N-α-Fmoc-amino acid
Reaction times : peptides containing Arg, 4-12 h (Wang resin) Reagent: Ninhydrin, Phenol, KCN + peptide-resin 110 ℃, 5 minutes The N-terminus is protected with the Fmoc group, which is stable in acid, but removable by base. Positive results : a blue to blue-violet color of resin and solution Coupling reaction monitoring Peptide acids Introduction C for peptides containing Arg or Trp Fmoc deprotection monoc-based SPPS A: 95% TFA + 5% H2O Resin for peptide amides: Any side chain functional groups are protected with base stable, acid labile groups. Y: Activating group 110 ℃, 5 minutes Coupling reaction monitoring
Resin for peptide amides:
95% TFA
Peptide amides
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一、多肽合成概论1．多肽化学合成概述：1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖.今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善.Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等.多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。
它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。
到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。
多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。
通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。
多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。
近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。
本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。
从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。
其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。
重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法，2．固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。
过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。
现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。
为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。
羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。
化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。
由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，如图：具体合成由下列几个循环组成：一、去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。
二、激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。
活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。
在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。
循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
三、洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。
2.1 树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。
用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。
根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。
BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。
氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。
氨基、羧基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。
同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。
最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。
1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc 合成法得到了广泛的应用。
羧基通常用形成酯基的方法进行保护。
甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。
对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。
保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。
如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。
精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。
固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。
其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。
裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。
合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。
4．固相合成的特点及存在的主要问题固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。
固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。
5．固相合成的研究发展前景固相多肽合成已经有40年的历史了，然而到现在，人们还只能合成一些较短的肽链，更谈不上随心所欲地合成蛋白质了，同时合成中的试剂毒性，昂贵费用，副产物等一直都是令人头痛的问题，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展。
在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA脱Boc基时，有约1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽越大，这样的丢失越严重；此外，酸催化会引起侧链的一些副反应.Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类.1978年，Chang、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino［3］报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成.Fmoc法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基.侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂和1%TFA可切除的二烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理.6. Fmoc―氨基酸的制备和侧链保护Fmoc基团是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六环溶液中，通过以下反应引入到氨基酸中的：理想的Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除.下面对其做一介绍.6.1Asp和GluAsp和Glu侧链羧基常用t-Bu保护.可用TFA、TMSBr等脱除.但是用t-Bu保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.6.2Ser、Thr和Tyrser、Thr的羟基及Tyr的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先ser制成苄氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser和Thr还可用苄基保护，Ser用苄醇引入苄基、Thr用溴苄引入苄基.6.3Asn和GlnAsn和Gln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn和Gln的α-羧基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氰基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基，2，4，6-三甲氧苄基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFA脱除.6.4HisHis是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护.对咪唑环的非π-N开始用苄基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌啶羰基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.对咪唑环π-N保护，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度较差.6.5CysCys的－SH具有强亲核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类：一类用TFA可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基和三苯甲基等；第二类可用(CF3CO)3T1／TFA脱除，对TFA稳定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如苄基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巯基试剂和磷试剂还原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脱保护.6.6ArgArg的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个胍基氮原子.保护基分四类：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧羰基应主要有Boc和二金刚烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦联反效率不高，哌啶理时不处稳定，会发生副反应；Adoc保护了两个非π－N，但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较难脱除.近年来2，3，6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在TFA作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好.6.7LysLys的ε-NH2必须加以保护.但与α－NH2的保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去.ε－NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基，其它常用的保护基有苄氧碳基和Boc.6.8Fmoc基团的脱除Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应条件很温和.反应过程可表示如下：。