国内外多肽药物杂质研究比较

国内外多肽药物杂质研究比较

生化药品及基因工程药物室任雪

杂质研究及控制是药品质量控制的核心内容之一，《合成多肽药物药学研究技术指导原则》中提出，有关物质检查是反映多肽化学纯度的重要指标之一，有关物质检查的方法学验证应能证明所采用的方法可以有效分离目标多肽与工艺杂质（例如缺失肽）、降解产物（例如二硫键交换或氧化产物）、聚合物等[1]。

杂质谱是对存在于药品中所有已知杂质和未知杂质的总的描述。在多肽药物杂质研究方面，国外已步入杂质谱控制研究阶段，而我国还停留在杂质控制研究阶段。EP7.0中众多（但不是全部）多肽药物品种项下都对已知杂质分别制订了限度，并列出了已知杂质的名称及结构式。举例如下[2,4]：

1. 普罗瑞林，原名促甲状腺素释放激素，氨基酸序列为：5-氧代-L谷氨酰-L组氨酰-L 脯氨酰胺，是人工合成的三肽激素，与天然下丘脑神经素完全一致，可促进垂体促甲状腺素的合成和释放，还具泌乳素释放激素活性及抗休克活性。

普罗瑞林原料药收载于EP7.0，ChP2010未见收载。EP7.0中杂质项下列举了5种已知杂质，分别为A. 5-氧代-L-谷氨酰-D-组氨酰-L-脯氨酰胺；B. 5-氧代-D-谷氨酰-L-组氨酰-L-脯氨酰胺；C. 5-氧代-L-谷氨酰-L-组氨酸；D. 5-氧代-L-谷氨酰-L-组氨酰-L-脯氨酸；E. (3S，8aS）-3-(1H-咪唑-4-酰甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(环(-L-组氨酰-L-脯氨酰))。其中杂质A、杂质B为消旋产物；杂质C为缺失肽；杂质D为脱酰胺产物；杂质E为缺失肽环化产物。在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中规定，杂质A与主峰的分离度不得小于2.5。

2. 亮丙瑞林，是化学合成的两端封闭的水溶性九肽，氨基酸序列为：5-氧代-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L精氨酰-N-乙基-L-脯氨酰胺，为下丘脑产生的类黄体生成激素释放激素（或称促性腺激素释放激素）的高活性类似物。连续使用用于抑制前列腺恶性肿瘤、中枢性性早熟、子宫肌瘤及子宫内膜异位症，以醋酸盐形式起作用。

亮丙瑞林原料药收载于EP7.0，ChP2010未见收载。EP7.0中杂质项下列举了11种已知杂质，对其中杂质A、B、C、D规定了限度范围。除杂质D为4位丝氨酸侧链羟基被乙酰化的产物外，杂质A至I均为第1或2或3或4或5或6或7位氨基酸各自发生不同消旋的产物；杂质J为8位精氨酸侧链胍基化衍生物；杂质K为4位丝氨酸脱水衍生物即[4-去

氢丙氨酸]亮丙瑞林。在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中规定，杂质B峰与主峰的分离度不得小于1.5。

3. 缩宫素，是人工合成或取自健康家畜的垂体后叶组织的环形九肽激素，氨基酸序列为L-半胱氨酰-L-酪氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-门冬酰胺酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-甘氨酰胺环(1→6)二硫化物，在胎生哺乳动物中具有刺激子宫收缩和泌乳的作用。缩宫素原料药收载于EP7.0，ChP2010未见收载。虽然在EP7.0中未列举可检测杂质，但在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中均有规定，主峰与去氨加压素峰（缩宫素的结构与去氨加压素的结构十分近似，仅在第1、3、8位有区别）的分离度不得小于5.0。

4. 醋酸去氨加压素，是血管加压素的合成类似物，氨基酸序列为3-巯基丙酰-L-酪氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-门冬酰胺酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酰-L-甘氨酰胺环(1→6)二硫化物。在血液中稳定性增加，半衰期延长，较血管加压素和赖氨加压素具有更强和更持久的抗利尿活性，且加压的副作用比精加压素降低400～800倍，同样也可激活血液因子Ⅷ和纤溶酶原活性。用于中枢性尿崩症，遗尿症，术中止血及预防出血，及出血性疾病。

醋酸去氨加压素原料药收载于EP7.0，USP32，ChP2010未见收载。EP7.0中杂质项下列举了7种可检测杂质，其中杂质A、B和C分别为5位门冬酰胺或4位谷氨酰胺或9位甘氨酰胺的脱酰胺产物；杂质D为8位L-精氨酸消旋化产物；杂质E和F分别为4位谷氨酰胺或5位门冬酰胺乙酰氨甲基化的产物；杂质G为9位甘氨酰胺二甲基化产物。EP7.0及USP32在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中均有规定，主峰与缩宫素峰（缩宫素的结构与去氨加压素的结构十分近似，仅在第1、3、8位有区别）的分离度不得小于1.5。

5. 卡贝缩宫素，是合成的缩宫素类似物，氨基酸序列为丁酰-L-甲基酪氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-门冬酰胺酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-甘氨酰胺环(1→6) 一硫化物,据报道有更长的作用时间。

有关研究显示，卡贝缩宫素中可检测到以下4种已知杂质，分别为5位门冬酰胺消旋化产物、6位半胱氨酸消旋化产物、卡贝缩宫素亚砜I、卡贝缩宫素亚砜II、4位谷氨酰胺脱酰胺产物、9位甘氨酰胺脱酰胺产物。系统适用性要求中涉及到5位门冬酰胺消旋化产物峰与主峰的分离度不小于1.5，有关物质检查中对前四种列出的杂质分别规定了相对保留时间和限度范围。

6. 苯赖升压素，是合成的醋酸九肽，为血管加压素类似物，氨基酸序列为：L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L门冬酰胺酰-L半胱氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酰-L-甘氨酰胺环(1,6)-二硫化物。其抗利尿作用弱于血管加压素。当禁用拟交感神经药时，被用

作口腔使用局麻药后的血管收缩剂，也作为治疗口腔疼痛和炎症的制剂成分之一。

苯赖升压素原料药收载于EP7.0，ChP2010未见收载。EP7.0中杂质项下列举了6种已知杂质，对每一种已知杂质都规定了限度范围。杂质A为1，6位半胱氨酸开环并乙酰胺甲基化的还原产物，杂质B和F分别为4位谷氨酰胺或5位门冬酰胺脱酰胺产物；杂质C和D分别为(1，6，)( 1，，6)或(1，1，)( 6，6，)二硫键产物；杂质E为N端乙酰化产物。在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中规定，杂质C峰与杂质D峰的分离度不得小于1.5。

7. 替可克肽，为人工合成的二十四肽，其氨基酸序列与人促肾上腺皮质激素的前24个残基相同，为L-丝氨酰-L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-谷氨酰-L-组氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-色氨酰-L-甘氨酰-L-赖氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酰-L-甘氨酰-L-赖氨酰-L-赖氨酰-L-精氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-酪氨酰-L-脯氨酸。可利用形式为含水醋酸盐，有增加肾上腺分泌皮质激素的速度，用于肾上腺皮质功能减退。

替可克肽原料药收载于EP7.0，ChP2010未见收载。EP7.0中杂质项下列举了1种已知杂质A和1种未知杂质B，并对这两种杂质都规定了限度范围，其中A为4位甲硫氨酸亚砜化产物。在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中规定，杂质B峰的峰高与替可克肽峰的峰谷之比不得小于3。

8. 鲑降钙素，是通过化学合成法或重组DNA技术法获得的与天然鲑降钙素结构相同的由32个氨基酸组成的多肽，氨基酸序列为L-半胱氨酰-L-丝氨酰-L-门冬酰胺酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-缬氨酰-L-亮氨酰-L-甘氨酰-L-赖氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-亮氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-苏氨酰-L-酪氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-苏氨酰-L-门冬酰胺酰-L-苏氨酰-L-甘氨酰-L-丝氨酰-L-甘氨酰-L-苏氨酰-L-脯氨酰胺（二硫桥：1→7）。它通过抑制破骨细胞活性抑制骨盐溶解以及对肾脏及胃肠道的调节，使血钙降低，能显著降低高周转性骨病的骨钙流失，是用于骨质疏松、变形性骨炎、高钙血症的治疗药物。

鲑降钙素原料药收载于EP7.0，USP32，ChP2010。EP7.0中杂质项下列举了7种可检测杂质，并对虽有杂质规定了限度范围。其中杂质E、F、G仅针对由重组技术得到鲑降钙素，杂质A、B、C、D针对化学合成或重组技术得到的鲑降钙素。杂质A为N端乙酰化的鲑降钙素；杂质B为9位亮氨酸消旋化产物；杂质C为22位酪氨酸脱除产物；杂质D为O酰基化鲑降钙素；杂质E为33位加甘氨酸产物；杂质F为二硫键被氧化的磺酸化产物；杂质G为33位加甘氨酸且二硫键被氧化的磺酸化产物。EP7.0及USP32在含量测定及有关物质项下的系统适用性要求中均有规定，主峰与杂质A的分离度不得小于3（USP32）或5.0

（EP7.0），杂质A的对称因子不得大于2.5；主峰与杂质E的分离度不得小于3.0。ChP2010中未记载任何可检测杂质结构，未对任何可检测杂质进行限度规定，仅将N-乙酰-半胱氨酰1-降钙素（即杂质A）用作系统适用性溶液成分之一，规定N-乙酰-半胱氨酰1-降钙素峰与鲑降钙素峰的分离度应不小于3.0，N-乙酰-半胱氨酰1-降钙素的对称因子应不大于2.5[3]。

以上文8个品种为例，我们可以窥豹一斑地看出，从短的三肽到长的三十二肽，无论含二硫键的环肽还是线性肽，国外企业对多肽类药物有关物质的研究都是比较深入的，每个品种确定结构的相关肽均有2到11个不等。已知结构的合成肽杂质共40种，其中消旋肽14种，占35%；脱酰胺肽8种，占20%；氧化肽4种，占10%；缺失肽3种，占8%；错位肽2种，占5%；其他如乙酰化肽、甲基化肽、胍基化肽或脱水肽共9种，占22%。用于系统适用性的杂质肽中，有38%为消旋肽。

相比较而言，我国在该方面做的工作还不够，各级质量标准一般仅在极为有限的品种项下用相关肽做了系统适用性试验，基本未规定过相关肽的相对保留时间及限度范围，通常仅采用面积归一化法或自身对照法进行有关物质检查，有的品种如缩宫素根本未将有关物质检查列入质量标准。当然，随着为人民用药安全有效服务意识的增强，注射剂标准提高任务、药品评价性抽验工作的逐年展开，我们力求对质量标准不断进行提高完善，向国际一流水平看齐。例如，在2010年由江苏省食品药品检验所完成的缩宫素注射液评价性抽验工作研究中发现，现行标准不能有效控制药品质量，体现在有关物质偏高，制剂中的有关物质由原料引入，须增加有关物质检查。江苏省所投入了很大的人力物力，采用强降解试验、半制备等措施，通过LC-MS等分析手段，对缩宫素注射液中的有关物质进行了深入探索式研究。

但是，其实最有条件进行药品杂质深入研究的不是各级检验所，而是生产企业自身。企业是药品生产人和最终责任人，最熟知自己产品的生产过程及在生产过程中哪些步骤可能引入哪些杂质，并结合一些分析手段如LC-MS-MS或CE-MS-MS，能够比较方便对杂质谱控制有较全面和细致的把握，进而可以改进生产工艺，提高产品质量。随着科技的不断发展及对药品质量要求的不断提高，要求企业在杂质控制方面加大投入力度，提高产品的质量控制水平及产品的质量。

当然，质量不是检测出来的，单单讲是生产出来的也不尽然，现在都在宣传QbD，全称是Quality by design，即质量源于设计。这个仿制药结构是确定了，但生产工艺不一定与原研厂一致，而生产工艺的不同直接导致药品有关物质种类、数量、含量产生差异，很可能出现新的杂质或超量杂质，这就需要按创新药思路进行质量研究，对新的生产工艺进行风险评估，制定质量标准[5]。

不积跬步，无以至千里；不积小流，无以成江海。作为为人民用药安全有效把关的生产者和检验者们，需要不断更新和提高知识和技术，积累杂质谱控制的经验，并落实到实处，力求将我们的药品质量推向一个更完美的水平。

参考文献

1《合成多肽药物药学研究技术指导原则》, 2007

2 EP7.0

3 ChP(中国药典). 2010. V ol Ⅱ(二部)

4李大魁，金有豫，汤光等译. 马丁代尔药物大典(原著第35版). 化学工业出版社.

5张哲峰. 浅谈杂质研究中的风险控制