2 文库定量流程-KAPA Library Quantifcation Kit
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3.4将16µL的混合物分配到每个PCR管或孔中。
3.5分别将4μL六种DNA标准品，待测定文库稀释液，对照稀释液和无模板对照（PCR级水）加入到适当的孔中，记录孔中加样的顺序。
3.6盖上管或密封PCR板，瞬时离心收集试剂至管底，并转移到qPCR仪器。
3.7反应条件设置
……………………..
步骤
温度
时间
ROXHigh
Applied Biosystems 7500, ViiA™7,QuantStudio™ 12K Flex, AgilentMx3000P™, Mx3005P™, and Mx4000™
ROXLow
Rotor-Gene™, DNA Engine Opticon™,Opticon™ 2, Chromo 4™ Real-TimeDetector, Mastercycler® eprealplex, SmartCycler®, Roche LightCycler® 480, RocheLightCycler Nano, Bio-Rad CFX96, andIllumina Eco™
•确保分配后尖端中没有残留的液体残留。
NoROX
3.反应体系和反应条件
3.1确定配置混合液的个数
需要一起加入样品孔进行定量的样品类型如下：
•六种DNA标准品（片段为452 bp的dsDNA片段）
•待测定文库稀释液n个
•对照稀释液m个（一般1-3个）（可选）
•无模板对照1个（NTCs）
混合液总个数为：（6+n+m+1）*3个重复*1.1
3.220µ反应体系如下
必须为每次测定新鲜制备稀释液，并在冰上或4°C下短时间保存。如果稀释的样品在室温下储存，或者在反应器设置之前长时间（即使是在4℃）储存，则计算的文库浓度可能是不准确的。如果必须重新测定样品，则必须为重复测定准备新的稀释液。
耗材和设备始终使用高质量，低DNA结合的PCR管/板和移液器吸头。
确保根据制造商的建议正确维护和定期校准qPCR仪器和移液器。
循环数
初始变性
95ºC
5 min
1
变性
95ºC
30 sec
35
退火/延伸/数据采集
60ºC
45 sec*
熔体曲线分析
65 – 95°C
*长插入文库（> 700 bp）增加到90秒。
注意事项
SYBR Green I染料（包含在KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix中）和ROX染料对光敏感。长时间暴露在直射光下会导致荧光信号强度的损失。
KAPA Library Quantifcation Kits的所有成分溶液在30次冻融循环中都是稳定的。
确保所有试剂在不使用时在-15ºC至-25ºC避光保存。
Tween®20可以提高移液准确度并减少DNA对塑料管和移液管吸头的吸附。
稀释DNA溶液（如NGS文库）对冷冻和解冻过程中的降解很敏感。不要将稀释的文库和标准品长时间保存在室温。
•每次移液步骤都要使用新的移液器吸头。标准品和/或样品之间的交叉污染将影响量化的准确性。
•在抽吸过程中，避免将移液器吸头放在试剂表面下太远，因为这可能会导致液体粘附在吸头外部。
•吸取所需体积的溶液后，在打出前检查移液器吸头，确保吸取了正确的体积。
•尽量将液体加入到尽可能靠近管底或孔的位置。
•在液体打出后上下移液2至3次，冲洗移液器吸头。
1.3如果第一次使用试剂盒，将Primer Premix（10X）（1 mL）加入KAPASYBR®FASTqPCR Master Mix（2X）（5 mL）瓶中。使用涡旋混合器彻底混合。如果您使用的是通用qPCR Master Mix试剂盒，并且仅使用ROX High或ROX Low，则在首次打开试剂盒时，可以使用引物将适当的ROX溶液（50X）（0.2 mL）添加到qPCR Master Mix中。以后使用时，每20μL反应使用12.4μL或每10μL反应使用6.2μL。
2.0µL
2.0µL
ROX High or Low (50X)(见表1)
0.4 µL
0 µL
水(PCR级别)
3.6 µL
4.0 µL
模板
4.0 µL
4.0 µL
总体积ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
20.0 µL
20.0 µL
3.3配置除模板以外的其他所有混合物，总体积为16µL*（6+n+m+1）*3个重复*1.1，混合并瞬时离心收集试剂至管底。。
2.2准备所需的对照稀释液（可选）。
表1.与KAPA SYBR FAST Universal qPCR Master Mix一起使用的推荐ROX类型
仪器型号
ROX
Applied Biosystems®5700, 7000, 7300, 7700,7900HT, StepOne™, and StepOnePlus™
准确的液体处理由于qPCR是一种非常灵敏的技术，可以检测到非常低的模板拷贝数，因此结果的可靠性高度依赖于精确的液体处理。
为了确保最高程度的准确性，这可以通过以下方式实现：
•始终确保试剂和样品在使用前完全解冻并彻底混合。
在解冻和混匀后，短暂离心可以去除管壁上的任何液滴。
•如果可能，请避免使用多通道移液器。
1.3中准备的混合物
12.4µL
水(PCR级别)
3.6µL
模板
4.0µL
总体积
20.0 µL
或跳过1.3步骤时，采用如下体系：
qPCR反应混合物
ROX
No ROX
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X)
10.0 µL
10.0 µL
Primer Premix (10X)1
1.4记录所有试剂的批号，以及引物（和ROX）加入qPCR Master Mix的日期。 KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixes与引物（和ROX）在30次冻融循环中保持稳定，在不使用时放在-20°C下避光保存。混合物可以在4℃下在避光储存≤1周，条件是它们在制备过程中或在随后使用时未被微生物和/或核酸酶污染。
文库定量流程
1.试剂准备
1.1制备适当体积的DNA稀释缓冲液
10mM Tris-HCl，pH8.0-8.5（25℃）+ 0.05％Tween 20（可选）。
室温或4°C下储存。使用前将缓冲液平衡至室温。
1.2确保KAPA Library Quantifcation Kit的所有组分完全解冻并彻底混合。
2.样品制备
2.1准备文库稀释液（使用DNA稀释缓冲液）。
文库样本先用DNA稀释缓冲液稀释至2ng/µL，再进行1/10000倍稀释（通过两次1/100稀释），具体方法如下：
取2µL文库，加入98µLDNA稀释缓冲液，彻底震荡混匀；
取2µL上一步稀释好的文库，加入98µLDNA稀释缓冲液，彻底震荡混匀。
3.5分别将4μL六种DNA标准品，待测定文库稀释液，对照稀释液和无模板对照（PCR级水）加入到适当的孔中，记录孔中加样的顺序。
3.6盖上管或密封PCR板，瞬时离心收集试剂至管底，并转移到qPCR仪器。
3.7反应条件设置
……………………..
步骤
温度
时间
ROXHigh
Applied Biosystems 7500, ViiA™7,QuantStudio™ 12K Flex, AgilentMx3000P™, Mx3005P™, and Mx4000™
ROXLow
Rotor-Gene™, DNA Engine Opticon™,Opticon™ 2, Chromo 4™ Real-TimeDetector, Mastercycler® eprealplex, SmartCycler®, Roche LightCycler® 480, RocheLightCycler Nano, Bio-Rad CFX96, andIllumina Eco™
•确保分配后尖端中没有残留的液体残留。
NoROX
3.反应体系和反应条件
3.1确定配置混合液的个数
需要一起加入样品孔进行定量的样品类型如下：
•六种DNA标准品（片段为452 bp的dsDNA片段）
•待测定文库稀释液n个
•对照稀释液m个（一般1-3个）（可选）
•无模板对照1个（NTCs）
混合液总个数为：（6+n+m+1）*3个重复*1.1
3.220µ反应体系如下
必须为每次测定新鲜制备稀释液，并在冰上或4°C下短时间保存。如果稀释的样品在室温下储存，或者在反应器设置之前长时间（即使是在4℃）储存，则计算的文库浓度可能是不准确的。如果必须重新测定样品，则必须为重复测定准备新的稀释液。
耗材和设备始终使用高质量，低DNA结合的PCR管/板和移液器吸头。
确保根据制造商的建议正确维护和定期校准qPCR仪器和移液器。
循环数
初始变性
95ºC
5 min
1
变性
95ºC
30 sec
35
退火/延伸/数据采集
60ºC
45 sec*
熔体曲线分析
65 – 95°C
*长插入文库（> 700 bp）增加到90秒。
注意事项
SYBR Green I染料（包含在KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix中）和ROX染料对光敏感。长时间暴露在直射光下会导致荧光信号强度的损失。
KAPA Library Quantifcation Kits的所有成分溶液在30次冻融循环中都是稳定的。
确保所有试剂在不使用时在-15ºC至-25ºC避光保存。
Tween®20可以提高移液准确度并减少DNA对塑料管和移液管吸头的吸附。
稀释DNA溶液（如NGS文库）对冷冻和解冻过程中的降解很敏感。不要将稀释的文库和标准品长时间保存在室温。
•每次移液步骤都要使用新的移液器吸头。标准品和/或样品之间的交叉污染将影响量化的准确性。
•在抽吸过程中，避免将移液器吸头放在试剂表面下太远，因为这可能会导致液体粘附在吸头外部。
•吸取所需体积的溶液后，在打出前检查移液器吸头，确保吸取了正确的体积。
•尽量将液体加入到尽可能靠近管底或孔的位置。
•在液体打出后上下移液2至3次，冲洗移液器吸头。
1.3如果第一次使用试剂盒，将Primer Premix（10X）（1 mL）加入KAPASYBR®FASTqPCR Master Mix（2X）（5 mL）瓶中。使用涡旋混合器彻底混合。如果您使用的是通用qPCR Master Mix试剂盒，并且仅使用ROX High或ROX Low，则在首次打开试剂盒时，可以使用引物将适当的ROX溶液（50X）（0.2 mL）添加到qPCR Master Mix中。以后使用时，每20μL反应使用12.4μL或每10μL反应使用6.2μL。
2.0µL
2.0µL
ROX High or Low (50X)(见表1)
0.4 µL
0 µL
水(PCR级别)
3.6 µL
4.0 µL
模板
4.0 µL
4.0 µL
总体积ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
20.0 µL
20.0 µL
3.3配置除模板以外的其他所有混合物，总体积为16µL*（6+n+m+1）*3个重复*1.1，混合并瞬时离心收集试剂至管底。。
2.2准备所需的对照稀释液（可选）。
表1.与KAPA SYBR FAST Universal qPCR Master Mix一起使用的推荐ROX类型
仪器型号
ROX
Applied Biosystems®5700, 7000, 7300, 7700,7900HT, StepOne™, and StepOnePlus™
准确的液体处理由于qPCR是一种非常灵敏的技术，可以检测到非常低的模板拷贝数，因此结果的可靠性高度依赖于精确的液体处理。
为了确保最高程度的准确性，这可以通过以下方式实现：
•始终确保试剂和样品在使用前完全解冻并彻底混合。
在解冻和混匀后，短暂离心可以去除管壁上的任何液滴。
•如果可能，请避免使用多通道移液器。
1.3中准备的混合物
12.4µL
水(PCR级别)
3.6µL
模板
4.0µL
总体积
20.0 µL
或跳过1.3步骤时，采用如下体系：
qPCR反应混合物
ROX
No ROX
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X)
10.0 µL
10.0 µL
Primer Premix (10X)1
1.4记录所有试剂的批号，以及引物（和ROX）加入qPCR Master Mix的日期。 KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixes与引物（和ROX）在30次冻融循环中保持稳定，在不使用时放在-20°C下避光保存。混合物可以在4℃下在避光储存≤1周，条件是它们在制备过程中或在随后使用时未被微生物和/或核酸酶污染。
文库定量流程
1.试剂准备
1.1制备适当体积的DNA稀释缓冲液
10mM Tris-HCl，pH8.0-8.5（25℃）+ 0.05％Tween 20（可选）。
室温或4°C下储存。使用前将缓冲液平衡至室温。
1.2确保KAPA Library Quantifcation Kit的所有组分完全解冻并彻底混合。
2.样品制备
2.1准备文库稀释液（使用DNA稀释缓冲液）。
文库样本先用DNA稀释缓冲液稀释至2ng/µL，再进行1/10000倍稀释（通过两次1/100稀释），具体方法如下：
取2µL文库，加入98µLDNA稀释缓冲液，彻底震荡混匀；
取2µL上一步稀释好的文库，加入98µLDNA稀释缓冲液，彻底震荡混匀。