AB 7500 2.0绝对定量简易操作流程
7500荧光定量PCR仪使用说明(相对定量)
开机
依次打开电脑显示屏、主机，输入开机密码“7500”。
放入反应板
注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。
（以下过程按字母顺序a→q进行操作）
创建反应板文件
双击电脑桌面上SDS软件图标 打开SDS软件；
在对话框中选择Create New Document…，或选择菜单栏File > New；
为每个反应孔指定探针和任务
为反应孔设置样品名
7500荧光定量PCR仪使用说明
注意事项：
实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。
PCR反应所用的96孔板、8联管或单管必须适合ABI7500专用，禁止使用凸盖PCR管。
使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。
实验数据用格式化U盘拷取，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于“FUWU”文件夹下的子文件夹中。
PCR实验室7500SOP
分子生物操作手册版本号：B修订号：0发布日期：文件标题：ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序文件编号：LAB-SOP-FZSW-011 生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第1 页，共4页【】ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111.目的：确保ABI7500仪器的正确使用及正常运行2.适用范围：美国应用生物系统公司生产的ABI7500实时荧光定量PCR仪3.运行环境：电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风：仪器的通风应该没有阻挡。
温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10～30℃之间。
湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。
空间：易于操作，安全。
4.操作程序：4.1开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
4.2 创建绝对定量反应板文件：4.2.1依次选择Start > Programs > Applied Biosystems 7500>Applied Biosystems 7500 SDS Software( )，以启动SDS 软件;或在桌面双击Applied Biosystems 7500 SDSSoftware( )图标。
4.2.2选择File （文件）> New （新建）。
4.2.3在New Document Wizard （新建文件向导）窗口中，从Assay （实验）下拉列表中选择Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线）。
接受Container （反应板类型）和Template （模板）字段中的默认设置（即分别为96-Well Clear（空白96 孔板）和Blank Document（空白反应板））。
AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程
1. 目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化.2. 范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。
3. 定义：无4. 职责:荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。
质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任.5. 内容：5。
1 室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75％.5.2 仪器操作5。
2。
1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。
5.2。
2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。
5.2.3 点击7500 Software v2。
3图标，打开软件.5。
2.4 按压仪器托盘上的按压位,待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置.检测8联PCR反应管用＊*反应孔模块，检测96孔PCR反应板用*＊反应孔模块。
（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）5。
2。
5 再次按压托盘使其滑入仪器。
5。
2。
6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63—62的模板，扩增参数是95°，10′；(95°，10″;63°,45″)×5cycles;（95°，10″;62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20μl反应体系.5。
2。
6。
1 在Setup—Plate Setup—Define Targets and Samples中，将Target Name下的T arget1改成FAM；点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX,点击Reportee下拉菜单，选择VIC。
5。
2。
6.2在Setup—Run Method-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20μl 反应体系）。
ABI 型使用维护操作规程
ABI 7500型荧光定量核酸扩增仪作业指导书1.目的：使ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2.范围：ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪。
3.性能参数：详见说明书4.程序：4.1.依次打开电脑显示器及电脑主机电源，进入windows XP 界面4.2.打开PCR主机电源4.3.点击桌面7500 software V2.0.6 图标，打开软件4.4.主界面点击SET UP 菜单下ADVANCED SETUP4.4.1.在试验属性界面：选择正确的机器型号，试验类型及试剂类型（探针法/染料法）4.4.2.在plate setup 界面，首先设定试验使用的探针，及样品名称，然后按照事先加样的位置顺序设定样品名称、类型，包括待检样本、阴性对照、阳性对照、阳性标准品、阳性室内质控样本。
4.4.3.在run method界面，编辑与试剂盒提供的温度程序相同的温度程序，包括温度与时间，及循环数4.5.将预先加好的0.2ML样品管按照设定顺序放置到仪器里面，进入到RUN界面，点击绿色START 按钮，弹出保存试验对话框，设定保存后，试验立即开始运行。
界面显示运行倒计时。
运行过程中在amplification plot界面可以查看实时的扩增曲线，在temperature plot界面可以查看实时的温度变化情况。
温度循环结束后试验自动结束。
5.结果分析5.1.在analysis setup里面修改各个探针的baseline与threshold数值，点击绿色analyze图标，软件及完成自动分析。
5.2.在amplification plot界面查看所有样品的扩增曲线。
6.整体曲线的观察,将所有曲线选中进行整体观察。
6.1.观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一 Ct值出现上涨的情况。
6.2.观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。
荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程及日常维护
荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程及日常维护曹蕾马扬光施小明【摘要】介绍了荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程，总结了其日常维护和注意事项，为其使用提供指导。
【关键词】荧光定量PCR仪操作规程维护荧光定量PCR仪将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。
1原理介绍实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。
荧光染料法：荧光染料能特异性掺人DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步[1]。
荧光探针法：探针的5端标记荧光报告基团（reporter R）3端标记淬灭基团（quencher Q），探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[1][2]。
通常，荧光擴增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。
为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。
荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct值。
模板的ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数[3]。
2操作规程2.1开机2.1.1依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。
ABI7500荧光定量PCR仪标准操作规程
1. 目的为规范使用人正确和正常的使用ABI 7500型核酸扩增荧光定量检测仪，保证扩增及结果分析的标准化、规范化，特制定本规程。
2. 适用范围适用于本公司ABI7500荧光定量PCR仪的操作。
3. 职责3.1使用人员负责本规程的实施。
3.2 设备使用人负责设备维护保养工作；设备责任人负责设备的定期维护保养工作。
3.3 质量监督员负责监督本规程的实施。
4.内容4.1 程序设置4.1.1 打开电脑及仪器电源，待仪器电源项显示power绿色状态。
4.1.2 双击电脑桌面上的7500 software V2.3 图标打开程序，打开程序单击OK，待软件连接仪器并测试校准状态后（若有出现连接失败可尝试重启电脑，检查USB线接口），出现如下界面，单击Design Wizard选项，红色箭头指示位置有个下拉菜单，如下图所示。
下拉菜单中有一个Advanced Setup（高级设置）选项，如箭头所示：点击这个选项，可以进入下面这个界面，①②③如上图所示，红色箭头从上到下指示的分别是①实验名称、②仪器型号和③反应程序类型。
（带*号的必需填）此图是上面图的延续（自己电脑显示不完全），红色箭头从上到下指示的分别是①Plate Setup 选项、②探针类型和③程序应用速度类型，一般使用的探针就是TaqMan 探针，速度类型选择默认就可以了（如果是7500fast 的话则有快速模式可以选择）。
下一步我们可以看到左上角的红色箭头指示的一个Plate Setup 选项，点击这个选项，就可以进入下一个设置界面。
红色箭头①和②指的是设定反应探针和反应样品名称，箭头③处可以填写反应探针名称（如P1,HBV ,HCV ）。
箭头⑤是选择报告荧光，一般使用的发光基团是FAM ，箭头⑥是选择粹灭荧光，达安现在使用的是TAMRA 荧光，科华现在使用的是BHQ ，在这个仪器中无此选择项，那么就选择none 。
箭头⑧处可以填写样品名称。
点击箭头④和箭头⑨处可以添加反应探针体系名称和样品名称。
7500Fast_操作流程
7500Fast_操作流程
7500Fast Real Time PCR简易操作流程（供参考）
1.打开电脑，等待WinXP桌面完全显示后打开7500Fast主机电源。
2.等待7500Fast主机“Power”指示灯稳定后，打开SDS软件。
3.创建绝对定量反应板文件：
a.选择Create New Document；
b.从Assay下拉列表中选择Absolute Quantification，然后单击
Next；
c.选择（或创建）所需探针加入到反应板文件中，然后单击Next；
d.为每个反应孔指定探针和任务，为标准品赋值，然后单击Finish；
4.选择Setup选项卡，选中样品对应的反应孔，在Well Inspector 窗口
中输入样品名，并检查探针和任务设置；
5.选择Instrument选项卡，设定PCR条件、反应体系；
6.选择File 〉Save as，保存反应板文件为***.sds；
7.放入样品板（管），单击Start开始反应程序（八连管、单管请使用
光学平盖），等待软件倒计时开始后再离开。
8.程序运行结束后，选择Results选项卡〉Amplification plot选项卡，
选择Auto Ct分析方法，点击Analysis 〉Analyze进行分析，选择Report选项卡查看结果。
9.选择File 〉Export，导出所需结果。
10.关机顺序：关闭SDS软件，关7500Fast主机，关电脑。
7500 2.0相对定量
AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.07500定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup（Fig1-1）。
Fig 12.默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）：Fig23.1在界面中设置基因及样品（Fig2-1）。
利用“Add New Target”（Fig2-2）添加新的基因，并编辑基因名称及所标记的荧光种类。
例如基因名称为18S，报告基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB，进行如下图的设定。
也可以通过下拉菜单进行不同的选择：TAMRA作为淬灭基团时选择TAMRA，其他非荧光淬灭基团选择None。
还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存或删除。
利用AddNew Sample（Fig2-3）添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在进行样品板的排布。
利用鼠标单击或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本（Fig3-1），同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照，Fig3）。
Fig33.3在“Select relative quantitaion settings”中设置内参基因及参照样本（Fig3-3）。
3.4在“Select the dye to use as passive reference”（Fig3-4）中设置参比荧光，如下。
荧光定量PCR仪标准操作规程
编制人：编制日期：年月日颁发部门：品保部
审核人：审核日期：年月日
批准人：批准日期：年月日生效日期：2014年06月01日分发部门：品保部分发号：
1.目的
规范ABI 7500荧光定量PCR仪操作，保证安全操作，延长仪器寿命
2.范围
适用于ABI 7500荧光定量PCR仪
3.职责
操作人负责本规程实施，部门负责人监督实施。
4.规程
4.1 实验程序运行：
4.1.1首先打开电脑，进入操作系统后，打开ABI 7500荧光定量PCR仪电源。
双击桌面上7500 software V2.0.6。
弹出Login对话框，默认的User Name为GUEST，点击Login as GUEST，点击OK运行软件。
4.1.2进入界面，选择Advanced Setup。
4.1.3点击Experiment Properties。
在Experiment Name栏输入实验名称。
4.1.4点击Plate Setup，点击Define Targets as Samples。
设定Target Name的Reporter 为FAM。
4.1.5点击Assign Targets and Samples。
设定96孔板。
4.1.5点击Run Method。
设定反应程序。
4.1.6点击Reaction Setup设定反应体系。
4.1.7点击Run菜单，点击START RUN。
开始运行PCR反应。
AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程
1. 目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2. 范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。
3. 定义：无4. 职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。
质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。
5. 内容：5.1 室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75%。
5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。
5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。
5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。
5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。
检测8联PCR反应管用**反应孔模块，检测96孔PCR反应板用**反应孔模块。
（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。
5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5 cycles；（95°，10″；62°，35″）×40 cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20μl反应体系。
5.2.6.1 在Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将T arget Name下的T arget1改成FAM；点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。
5.2.6.2在Setup-Run Method-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20μl反应体系）。
(完整word版)ABI7500-2.0软件使用指南0223XIE
打开电脑及仪器电源，待仪器电源项显示power绿色状态。
首先，双击电脑桌面上的图标打开程序，打开程序单击OK，待软件连接仪器并测试校准状态后（若有出现连接失败可尝试重启电脑，检查USB线接口），出现如下界面，单击Design Wizard选项，红色箭头指示位置有个下拉菜单，下拉菜单中有一个Advanced Setup（高级设置）选项，如箭头所示：点击这个选项，可以进入下面这个界面，①②③如上图所示，红色箭头从上到下指示的分别是①实验名称、②仪器型号和③反应程序类型。
（带*号的必需填）①②③而这个图是上面图的延续（自己电脑显示不完全），红色箭头从上到下指示的分别是①Plate Setup选项、②探针类型和③程序应用速度类型，一般使用的探针就是TaqMan探针，速度类型选择默认就可以了（如果是7500fast的话则有快速模式可以选择）。
下一步我们可以看到左上角的红色箭头指示的一个Plate Setup选项，点击这个选项，就可以进入下一个设置界面。
红色箭头①和②指的是设定反应探针和反应样品名称，箭头③处可以填写反应探针名称（如HBV ,HCV,或以公司名称DAAN 、KHB 。
）箭头⑤是选择报告荧光，一般使用的发光基团是FAM ，箭头⑥是选择粹灭荧光，达安现在使用的是TAMRA 荧光，科华现在使用的是BHQ ，在这个仪器中无此选择项，那么就选择none 。
箭头⑧处可以填写样品名称。
点击箭头④和箭头⑨处可以添加反应探针体系名称和样品名称。
箭头⑦和箭头⑩是选择对应探针体系和对应样品的曲线颜色，可选择也可以不选。
（另：探针跟样品设定后可保存，方便以后实验调用，具体是点击箭头①②下面的Saved Taeget ，下次调用则点击 Add Saved 。
就可调出。
）为了方便讲解，我假定有1个反应探针DAAN 和1个样本HBV1，如上图所示。
设定完成之后，我们点击红色箭头所指的选项，进入下个界面。
① ②③ ④ ⑤ ⑦ ⑥ ⑧ ⑨ ⑩在上图，我们可以看到一个类似反应板的界面，黑色箭头①指示的有玫瑰红色下划线那一排在选定反应孔后会显示出样本孔总数，标准品总数和阴性对照总数。
ABI7500实时荧光定量操作程序
ABI7500实时荧光定量操作程序ABI7500实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）操作程序是用于检测目标DNA的数量的一种实验方法。
在该操作程序中，使用ABI7500实时荧光定量PCR系统的仪器和相关试剂来进行PCR反应，然后通过荧光信号的变化，对PCR反应中目标DNA的数量进行定量。
下面是ABI7500实时荧光定量PCR操作程序的详细步骤：1.实验前准备a.准备所需试剂，包括PCR引物、PCR酶、荧光探针等。
b.预备PCR工作站，如PCR工作台、离心机、PCR仪等。
c.准备PCR反应管，标记每管的样品编号。
2.反应体系构建a.准备PCR反应液，根据实验需要，将反应组分如PCR引物、PCR酶、模板DNA、dNTPs等加入PCR反应管中。
b. 加入SYBR Green或荧光探针，用于在PCR反应过程中检测目标DNA。
3.试剂混合与装样a.将PCR反应液和样品混合均匀。
b.装样到ABI7500实时荧光定量PCR系统中的反应孔中，注意避免气泡的产生。
4.设置PCR程序a.打开ABI7500实时荧光定量PCR系统的软件界面，选择合适的PCR 模板。
b.设置PCR程序，包括温度、时间和荧光信号的检测。
5.PCR反应a.开始PCR反应，系统会根据设置的程序进行温度循环，在每个循环中，会记录荧光信号的变化。
b.实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化来判断PCR反应的进行情况。
6.数据分析a.实时记录荧光信号的数值，生成实时荧光曲线。
b.通过计算机软件对实时荧光曲线进行数据分析，计算目标DNA的相对定量值。
7.结果解读a.根据相对定量值来判断样品中目标DNA的数量。
b.结果的解读可以通过进行标准曲线法或内部参照法进行。
8.结束实验a.关闭ABI7500实时荧光定量PCR系统。
b.清理和消毒实验区域和实验工具。
总结：ABI7500实时荧光定量PCR操作程序包括实验前准备、反应体系构建、试剂混合与装样、设置PCR程序、PCR反应、数据分析、结果解读和结束实验等步骤。
人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程
人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定量PCR仪操作、维护及校准操作规程1 ABI7500实时荧光定量PCR仪概述7500型荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。
7500型将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可实时定量观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物的情况。
PCR实验结束后即刻得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。
7500型实时荧光定量PCR仪具有节省时间，灵敏度高，准确性好和避免产物污染等优点。
2 主要技术参数样品孔数：96孔样品基座，温度范围：4.0-99.9℃温度显示：经计算机计算的实际样品温度，精确到0.1℃加热冷却速度：平均温度变化速度1℃/秒温度准确性：正负0.25℃，35－100℃范围升降温重现性：任意温度达到时间误差小于5秒3 操作说明3.1 实验程序运行：3.1.1 首先打开电脑，进入操作系统后，打开7500仪器电源；3.1.2 双击桌面上的7500快捷方式，进入以下界面：3.1.3 点击，进入以下操作界面，按照默认设置，直接点击“完成”（Finish）：3.1.4 在96孔板中选择所放置样本对应的区域，如下图：3.1.5 点击按钮，在弹出的对话框中选择FAM-TAMRA荧光-淬灭基团，点击“Add To Plate Document”：3.1.6 点击按钮，如图所示，在弹出的对话框中勾选FAM荧光，内参荧光选择，点击“Close”：3.1.7 在选项下，逐个双击所选样本，设置样本类型和标准点定量值：3.1.8 点击选项，按照试剂盒说明书设置相应的扩增程序：3.1.9 点击按钮，为使用结果文件设定保存路径和名称。
3.1.10 点击“Start”开始运行扩增程序。
3.2 实验结果分析：3.2.1 点击按钮，打开使用结果文件；3.2.2 点击选项，进入结果分析操作界面。
点击下面的选项，双击纵坐标，选择Linear项，调整为线性坐标，点击“OK”确定：3.2.3 选取所有样本，手动设定阈值为最大荧光值的5%左右为宜。
(仅供参考)ABI7500 PCR 用户基本操作培训幻灯
心血管疾病相关基因表达量研究
溶血性胎儿贫血的早期检测
转基因食品(GMO)检测
癌基因表达量研究
细胞凋亡的研究 优生保健筛查
3600
病原体检测
新药研发
45
II类应用：等位基因鉴定
(终点读板)
• 基因突变分析
– 单基因遗传病的诊断，如血友病、地贫等
• SNP研究
– 疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP鉴定 – SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的
只有染料法才需要做融解曲线 探针法没有必要
[原始数据]
[导数图谱]
20
多重荧光定量原理
使用多条探针，标记多种颜色，定量多个基因
基因 1
基因 2
21
等位基因鉴定原理
野生型 (wt)
突变型 (mut)
两种探针加入同一管
23
等位基因鉴定实验数据
纯合子FAM 空白对照 24
杂合子 纯合子VIC
实时结果
报告荧光(Filter A)
FAM™ 或 SYBR® Green I
报告荧光(Filter B)
VIC™ 或 JOE™
报告或淬灭荧光(Filter C) NED™或 CY3™或TAMRA™
参比荧光(Filter D)
ROX™ 或 Texas Red®
报告荧光(Filter E)
CY5™
5
定量PCR的数学原理
1/8 a ¼a
Unk1 Ct=24.8
½a a
Unk1 浓度 = 0.2 a Unk2 浓度 = 0.1 a
相差2倍
相对定量：∆∆ CT法
依据：平均相对含量 = 2 – 平均ΔΔCT 好处：不需要做标准曲线
AB 7500 2.0绝对定量简易操作流程
applied biosystems 7500荧光定量PCR 仪绝对定量绝对定量实验实验实验简易简易简易操作流程操作流程SDS 2.07500定量PCR 仪 绝对绝对定量定量定量实验实验实验简易简易简易操作流程操作流程1. 双击桌面图标 ，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2. 默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面2.1 输入实验名称 （Experiment Name ）2.2 确认仪器型号2.3 在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4 选择试剂种类2.5 确认运行模式3. 进入Setup 下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target ）及样本（Sample ）：3.1 在的基因，并在Target记的荧光基团及淬灭基择NFQ-MGB ；荧光淬灭基团（如BH界面中设置基因及样品。
利用rget Name 中编辑基因名称，Reporter 和Quencher 淬灭基团。
对于Quencher 的选择，如果是如果是TAMRA 探针，请选择TAMRA ；如果是其BHQ ），请选择None 。
添加新encher 中选择所标MGB 探针，请选果是其他形式的非还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存(Save Target)或删除(Delete Target)。
利用添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷贝数。
ABI7500-2.0软件使用指南0223XIE
打开电脑及仪器电源，待仪器电源项显示power绿色状态。
首先，双击电脑桌面上的图标打开程序，打开程序单击OK，待软件连接仪器并测试校准状态后（若有出现连接失败可尝试重启电脑，检查USB线接口），出现如下界面，单击Design Wizard选项，红色箭头指示位置有个下拉菜单，下拉菜单中有一个Advanced Setup（高级设置）选项，如箭头所示：点击这个选项，可以进入下面这个界面，①②}如上图所示，红色箭头从上到下指示的分别是①实验名称、②仪器型号和③反应程序类型。
（带*号的必需填）①②③…而这个图是上面图的延续（自己电脑显示不完全），红色箭头从上到下指示的分别是①Plate Setup选项、②探针类型和③程序应用速度类型，一般使用的探针就是TaqMan探针，速度类型选择默认就可以了（如果是7500fast的话则有快速模式可以选择）。
下一步我们可以看到左上角的红色箭头指示的一个Plate Setup选项，点击这个选项，就可以进入下一个设置界面。
红色箭头①和②指的是设定反应探针和反应样品名称，箭头③处可以填写反应探针名称（如HBV,HCV,或以公司名称DAAN 、KHB 。
）箭头⑤是选择报告荧光，一般使用的发光基团是FAM ，箭头⑥是选择粹灭荧光，达安现在使用的是TAMRA 荧光，科华现在使用的是BHQ ，在这个仪器中无此选择项，那么就选择none 。
箭头⑧处可以填写样品名称。
点击箭头④和箭头⑨处可以添加反应探针体系名称和样品名称。
箭头⑦和箭头⑩是选择对应探针体系和对应样品的曲线颜色，可选择也可以不选。
（另：探针跟样品设定后可保存，方便以后实验调用，具体是点击箭头①②下面的Saved Taeget ，下次调用则点击 Add Saved 。
就可调出。
）为了方便讲解，我假定有1个反应探针DAAN 和1个样本HBV1，如上图所示。
设定完成之后，我们点击红色箭头所指的选项，进入下个界面。
，① ②③ ④&⑦ ⑥ ⑧ ⑨ ⑩在上图，我们可以看到一个类似反应板的界面，黑色箭头①指示的有玫瑰红色下划线那一排在选定反应孔后会显示出样本孔总数，标准品总数和阴性对照总数。
ABPCR仪操作规程
ABPCR仪操作规程1、标本先处理，放入仪器后再进行以下操作。
记住标本所放的位置，设定反应板位置。
2、打开AB7500 PCR仪，双击桌面上。
3、点左上角文件（file）→ne w→出一界面点下一步（next），添加HBV（或HCV）探针，下一步，选中标本位置，选中Use HBV，close,点完成Finish。
稍等，提示与仪器连接完成。
4、选中标准品位置，task中选standard，单个设标准品浓度，Quantity，如5E5。
5、双点击U，添加sample name 如1，每个标本位置设置完成，包括质控。
6、点Instrument，在这一界面设扩增程序。
7、另存实验文件名（Fin e→sava as→E:date→Fine name 如20090429 保存。
8、在Instrumen 中选start，仪器开始运行（时间可能稍长一点，等待），时间倒记时，至实验结束。
9、在Result s→Amplifiantion Plot 选中全部标本（用鼠标同时按Ctrl或 Shift键操作）.10、Manual ct→ Manual Baseline →stant 6 →End 12,调整阈值，分析结果（Analyze），保存。
11、结果导出到D盘。
Fil e→Expor t→Result s→D:YT X→文件名，如20090429→save。
12、双击桌面中，解码程序中（或点左上角重启接口，显示解码程序），点结果文件如20090429，点检验项目如HBVDNA，入库。
13、在报告单中修改低于500的结果，为〈5.0E+2，打印报告单。
用已经设置好的程序打开（在桌面上），如HBV-KH或HCV-KH 标本先处理，放入仪器后再进行以下操作。
记住标本所放的位置，设定反应板位置。
1、打开AB7500 PCR仪，打开桌面上的HBV-KH或HCV-KH，（点击Retry,）提示与仪器连接完成。
2、选中标本位置点击（可全部选中，用Ctrl键），选中Use HBV，close。
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applied biosystems 7500荧光定量PCR 仪
绝对定量绝对定量实验实验实验简易简易简易操作流程操作流程
SDS 2.0
7500定量PCR 仪 绝对绝对定量定量定量实验实验实验简易简易简易操作流程操作流程
1. 双击桌面图标 ，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500
Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2. 默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面
2.1 输入实验名称 （Experiment Name ）
2.2 确认仪器型号
2.3 在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve
2.4 选择试剂种类
2.5 确认运行模式
3. 进入Setup 下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target ）及样本（Sample ）：
3.1 在
的基因，并在Target
记的荧光基团及淬灭基择NFQ-MGB ；荧光淬灭基团（如BH
界面中设置基因及样品。
利用
rget Name 中编辑基因名称，Reporter 和Quencher 淬灭基团。
对于Quencher 的选择，如果是如果是TAMRA 探针，请选择TAMRA ；如果是其BHQ ），请选择None 。
添加新
encher 中选择所标MGB 探针，请选
果是其他形式的非
还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存(Save Target)或删除
(Delete Target)。
利用添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选
或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中
指定该反应孔的类型（S代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代
表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个
梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后
在Quantity中输入拷贝数。
按照相同操作，完成标准曲线其他数据点的设
置（建议设置5个梯度）。
4.在Setup下的Run Method界面中，设定反应条件。
5.点击，文件储存成Experiment Document Single Files（*.eds）格式，
然后按下按钮，反应即开始进行。
6.实验结束后，点击右上角的Analyze按钮，软件将显示实验结果：
6.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示
方式。
如果想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
6.2查看标准曲线时，可通过更改Plot Settings来改变标准曲线的显示方式。
Eff%代表扩增效率。
R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，建议在0.99以上。
6.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
6.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情
况。
黄色三角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，
以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中查看。
7.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果
（左图）。
若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save As，存成JPEG格式的图片（右图）。