真菌毒素分析

真菌毒素分析

一般固体食品多选用浸渍、洗脱、索氏回流方法等，将样品和提取液混合后搅拌30～40min，或快速搅拌3min；液体食品则多选用液液分配的方法。从动物组织中提取真菌毒素时，为了降低动物蛋白质对实验结果的干扰，同时为使与某些蛋白质结合的毒素(如赭曲霉毒素A，ochratoxin A，OTA)有效释放出来，在提取溶剂系统中可适当加入一些蛋白水解酶以提高回收率。必须对样品提取液进行分离纯化，在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质，以保证测定结果的准确度。通常是将提取的有机溶剂经石油醚或正己烷处理，以除去脂质和杂质。但这一方法较为烦琐，且效果也不尽如人意。柱色谱法是最常用的净化方法，其具体方法虽因样品不同而有所差异，但其基本操作是相同的。

真菌毒素含量的检测方法一直是制约真菌毒素与人类疾病研究进展的关键。真菌毒素含量的检测方法通常分为三类：①理化检测方法，包括层析、气相色谱、液相色谱、气(液)质联用等；②生物学检测方法，包括皮肤毒性实验、致呕吐实验、种子发芽实验等；③免疫化学检测方法，利用抗原抗体反应的原理进行真菌毒素检测，目前较为常用的是酶联免疫吸附试验(EusA)。三类方法中以免疫化学检测法灵敏度最高，但因需要特殊的抗体而受限制。

真菌毒素的分析目前最常用的方法是理化检测方法，分析过程一般分为以下几个步骤。

一、提取

从样品中提取真菌毒素回收率的高低对于检测结果的准确性影响很大。食品基质严重影响真菌毒素的提取。食品基质不同，所采用的提取方法和溶剂系统各异。一般固体食品多选用浸渍、洗脱、索氏回流方法等，将样品和提取液混合后搅拌30～40min，或快速搅拌3min；液体食品则多选用液液分配的方法。从动物组织中提取真菌毒素时，为了降低动物蛋白质对实验结果的干扰，同时为使与某些蛋白质结合的毒素(如赭曲霉毒素A，ochratoxin A，OTA)有效释放出来，在提取溶剂系统中可适当加入一些蛋白水解酶以提高回收率。

在食品和农产品基质中提取真菌毒素所选择的溶剂取决于待测毒素种类(一种还是多种)、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性和价格、非测定成分(杂质)在提取溶剂中的分配系数等。一般选用毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统。常用的真菌毒素提取溶剂包括甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙腈和水的一种或多种不同配比的混合物。

评价一种溶剂系统提取效果优劣的依据是回收率和提取时间，优良的溶剂系统应是毒素回收率高、干扰杂质少、提取时间短。如将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxvnialenol，DON)标准品添加到饲料中，用乙腈水(21：4，体积比)充分混合搅拌3min即可将毒素几乎全部提取出来，而要从天然污染的饲料中提取相当量的该毒素则需要16min，因此确定检测方法的回收率时应以天然污染的样品为基

准。对伏马菌素(fumonisins)的研究结果显示，虽然甲醇一水(80：20或75：25，体积比)是从玉米及其制品中提取天然污染伏马菌素B1、B2和B3的常用溶剂，并已成为AOAC法定方法中的指定提取溶剂系统，但在振荡条件下，乙腈一水(50：50，体积比)对玉米中伏马菌素的提取效果优于甲醇一水。用乙腈一甲醇一水(25：25：50，体积比)和甲醇一水(80：20、，体积比)分别提取玉米片中天然污染的伏马菌素七次，结果前者的提取效果优于后者。待测食品基质与溶剂之比是影响毒素回收率的又一因素。AoAC最佳食品(best foods)方法中规定分析花生中的黄曲酶毒素(aflatoxins，AFs)时提取溶剂(甲醇一水，55：45，体积比)与样品之比为2.5:1，但实践证明该比例并非最佳，理想的配比方案应高于2．5：1，特别是分析花生粗粉中的AFs时更应增加提取液的用量。

近来的研究表明，提取温度影响毒素的回收率。适当升高提取温度可增加玉米及其制品中伏马菌素的回收率。正常情况下用乙腈：水(3：1或1:1，体积比)提取伏马菌素的回收率优于甲醇：水(3：1或4：1，体积比)，但当温度升至80℃时，后者对玉米中伏马菌素的提取效率等同或高于前者。

二、分离纯化

因为样品中含有大量的蛋白质、色素、脂肪、糖和无机盐等多种物质，干扰物质在提取时也会进入提取液中，从而干扰待测毒素的测定。因此必须对样品提取液进行分离纯化，在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质，以保证测定结果的准确度。通常是将提取的有机溶剂经石油醚或正己烷处理，以除去脂质和杂质。但这一方法较为烦琐，且效果也不尽如人意。柱色谱法是最常用的净化方法，其具体方法虽因样品不同而有所差异，但其基本操作是相同的。

根据待测物质的性质，r柱色谱净化可分别使用吸附色谱柱和分配色谱柱。常用的吸附剂有硅镁型吸附剂、氧化铝、活性炭、硅胶等，聚酰胺也可用作净化剂。常用的分配色谱固定相物质有硅藻土、纤维素等。用柱色谱净化，除使用单一的吸附剂外，也可将多种吸附剂混合使用。其方法有两种：一是分段装柱法，如用硅藻土、硅镁型吸附剂及活性炭等分段装柱净化提取液；二是混合装柱，即将各种吸附剂混合后装柱，如活性炭、氧化铝、硅藻土混合装柱净化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的提取液。

正相硅胶柱色谱是真菌毒素最常用的净化方法。早期研究一般用长达20mm×300mm的大柱子，随着分析所需样品量减少的要求，小柱净化得到了普遍的应用。这种方法不仅节省溶剂而且大大缩短了净化时间。几种市售预处理小柱包括正相Sep—pak和反相Sep—pak柱、B(md—Elute NH2、Floi‘isil、液一液萃取柱和活性炭氧化铝柱曾被用于真菌毒素提取液的净化。利用SPE(固相萃取)分离纯化真菌毒素的技术已经很成熟，这一方法是将提取的有机溶剂浓缩后，过SPE 柱，洗脱杂质，然后在把目标毒素洗脱下来进行检测。目前还发明了“免疫亲和柱”的分离纯化方法，所谓免疫亲和即是在载体上附着了目标毒素的抗体，利用抗原抗体反应来特异地分离目标毒素。