第四章植物遗传转化技术
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
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3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究植物次生代谢产物是指在植物体内不参与基本生命活动，但在植物生长发育、适应环境和与外界的相互作用中发挥重要作用的化合物。
这些化合物的种类繁多，包括单萜、生物碱、黄酮类、苯丙素类等。
它们不仅对植物自身有重要生理功能，而且对人类和动物也具有重要药用、食用和工业用途。
植物次生代谢产物的遗传转化是指通过遗传工程手段，将植物细胞中的代谢途径重定向到制备某种次生代谢产物上。
通过转化后的植物，可在量上和质上有所改变，使之适应更广泛的应用。
近年来，植物次生代谢产物的遗传转化技术已经得到广泛的研究和应用。
一、植物次生代谢产物的遗传转化方法1、基因克隆基因克隆是遗传转化的基础。
植物次生代谢产物的代谢途径复杂，往往涉及多个基因的调控和协同。
因此，精准地克隆和分离涉及到的基因，是植物次生代谢产物的遗传转化研究的重要前提。
2、遗传转化技术遗传转化技术是指将外源基因（如酵母、细菌、动物等）导入植物，使其在植物体内表达。
常用的植物遗传转化技术有农杆菌介导遗传转化、微粒轰击法、基因炮法等。
通过遗传转化技术，可以在植物中导入指定的基因，构建其次生代谢产物合成途径。
3、分子改造分子改造是指利用现代分子生物学技术，对已知基因进行修改以达到人为控制次生代谢物质规模的目的。
常用的分子改造技术有基因沉默、基因敲除、反义基因等。
二、植物次生代谢产物的遗传转化应用研究1、药物应用植物次生代谢产物是开发药物的重要来源之一。
利用遗传转化技术，可以大量生产与已知药物相似的次生代谢产物，用于药物筛选和研发过程中的临床扩展。
近年来，通过植物遗传转化的方式生产的药物已经接近商业生产阶段，其中最为成功的是肺癌药物紫杉醇。
2、食品应用植物次生代谢产物还可以应用于食品领域。
通过遗传转化技术，植物可以生产出与已知食品相似的次生代谢产物，获得更佳的口感和口味。
此外，植物次生代谢产物还可以增强食物的营养价值，如增加维生素、蛋白质等。
遗传转化技术
遗传转化技术遗传转化技术（Genetic transformation）是一种将外源DNA导入目标细胞以改变其遗传性状的生物技术。
通过遗传转化技术，科学家可以将特定基因导入目标生物体，从而使其表达具有特定功能的蛋白质或产生特定的代谢产物。
这项技术在农业、医学和生物学研究领域都有重要的应用，可以帮助改良农作物、生产药物和研究基因功能等。
本文将从遗传转化技术的原理、方法、应用和未来发展等几个方面进行详细介绍。
一、遗传转化技术的原理遗传转化技术的原理是通过将外源DNA导入目标细胞，使其在目标细胞中稳定表达而产生特定的遗传性状。
这一过程包括DNA的导入、整合和表达等步骤，下面将分别介绍这些步骤。
1. DNA的导入DNA的导入是遗传转化的第一步，有多种方法可实现DNA的导入，包括化学转化、生物弹道法、冷冻转化法等。
其中，最常用的方法是利用冷冻转化法和冷冻方式使DNA导入目标细胞。
此外，也可以利用质粒、病毒和细菌等载体将DNA导入目标细胞。
2. DNA的整合DNA的整合是指外源DNA在目标细胞中的稳定整合，以确保其可以稳定地在细胞中传递和复制。
整合是遗传转化的关键步骤，其研究是提高转化效率和稳定性的重要途径。
3. DNA的表达DNA的表达是指外源DNA在目标细胞中被转录和翻译，最终产生特定的蛋白质或代谢产物。
DNA的表达与其整合程度、基因调控、转录水平等因素有关，对DNA的表达进行调控是提高遗传转化效率和稳定性的重要手段。
二、遗传转化技术的方法在遗传转化技术中，有多种方法可以将外源DNA导入目标细胞，并实现其稳定表达。
这些方法包括冷冻转化法、生物弹道法、基因枪法、质粒介导和病毒介导等，下面将对这些方法进行详细介绍。
1.冷冻转化法冷冻转化法是通过使目标细胞在低温条件下，先后进行冷冻和解冻，并向其注入DNA，利用渗透剂和真核细胞基因组重复生成的能力，使外源DNA稳定地整合到目标细胞的方法。
该方法简单、操作方便，适用于多种生物体。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
转基因育种技术优秀课件
常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目 的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。
优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统
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2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直 接分化出不定芽形成再生植株。
转基因育种技术优秀课件
第一节 转基因育种的概念
一、植物遗传转化（植物基因工程）
以植物为对象，采用重组DNA 技术将外源目的基因导入受体植物基因 组，最后获得外源目的基因正确表达和稳 定遗传的新植物类型。
核心技术是重组DNA技术
重组DNA（recombinant DNA）：是指人工创造的自然界
中不存在的DNA分子。主要指利用不同生物来源的DNA分子拼
以病毒载体和质粒载体介导的遗传转化比较多。
五、Ti质
粒 有一种土壤细菌,称为农 杆菌，它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤， 细菌的致瘤能力来源于细菌内的一个 额外染色体即质粒(plasmid)，称Ti质 粒。
优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传 物质的能力强，导入外源基因成功率高，更易 获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转 化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表 达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍 体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过 程。
缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长 条件的限制。
色体组中，并再
良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、必须具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高
效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4、对筛选剂敏感； 5、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源
园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
园艺植物遗传转化
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第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
转基因育种技术
大肠杆菌质粒:
质粒是一种相对分子质量较小、独立于细 菌染色体DNA之外的能自我复制、易分离 和导入的环状双链 DNA，有两种类型：松 弛型和严紧型。 自然条件，质粒需要通过接合作用才能从 一个细菌转移到新的质粒，但需要 “mob”gene，而大多数质粒都不含有该基 因；因此需要在实验条件下通过转化进行 质粒的转移。
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？
G AA T T C C T T AA G 用同种限制酶切割 G AA T T C G G AA T T C G G AA T T C C T T AA G
C T T AA
C T T AA
基因的针线：DNA连接酶
目的基因与运载体结合-----形成重组DNA
PCR扩增仪
目的基因与运载体结合-----形成重组DNA
用限制酶切割目的基因 和用相同的限制酶切割 质粒使之出现一个切口， 将目的基因插入切口处， 让目的基因的黏性末端 与切口上的黏性末端互 补配对后，在DNA连接 酶的作用下连接形成重 组DNA分子
提取质粒并用 限制酶切割
Genetically Modified Cotton (contains an bacterial gene for pesticide resistance)
Standard Cotton
转 基 因 植 物
抗除草剂牵牛花
抗病桑树
抗虫番茄
抗盐，抗旱，抗寒 改变花卉颜色、花期 抗早熟……
本章内容提要
人工基因合成法
取 出 DNA
用限制酶 切断DNA
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究：植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究是现代生物技术领域的一个重要分支，它通过操纵植物的基因来改变其性状和功能，为农业、生物医学和环境保护等方面提供了广阔的应用前景。
本文将介绍植物基因工程的原理和遗传转化技术的发展现状，以及其在农业和医学领域的应用。
一、植物基因工程原理植物基因工程是指通过人为干预植物基因组，将外源基因导入植物细胞，并使其在植物中表达。
其核心技术是DNA重组技术，具体包括以下几个步骤：1. 外源基因的克隆：将具有特定功能的基因从其他生物体中分离出来，并经过体外扩增，得到足够的DNA片段。
2. 载体构建：将目标基因与适当的表达载体连接，构建成重组DNA。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化方法：将重组DNA导入植物细胞。
常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化等。
4. 选择与筛选：利用选择标记基因或者报告基因等，对经转化的植株进行筛选和鉴定，确保目标基因已经成功导入植物细胞。
5. 后续培养：将转基因植株培养至成熟植株，并进行繁殖和观察，验证目标基因的功能和表达。
二、遗传转化技术的发展现状随着生物技术的不断进步，植物遗传转化技术也得到了广泛应用，取得了许多重要成果。
目前常用的植物遗传转化技术包括农杆菌介导的转化、基因枪介导的转化、电击法等。
农杆菌介导的转化是最常用的植物遗传转化技术之一，利用农杆菌通过水分或创伤进入植物细胞，将外源基因导入植物基因组。
该技术具有高效性和选择性，并且适用范围广泛，在获得转基因植株方面具有重要作用。
基因枪介导的转化是一种直接将外源DNA通过高速银粒枪或金粒枪射入植物组织的方法。
该技术能够克服农杆菌介导的转化对组织的要求较高的限制，使得更多的植物种类能够进行遗传转化。
电击法是一种利用暴露在电场中的植物细胞的特定瞬间可逆孔效应，使得外源DNA通过电穿孔方式导入细胞的方法。
该技术常用于难以转化的植物种类，如谷物、树木等。
植物的遗传改良与转基因技术
转基因植物的应用领域
01 抗病虫害
转基因植物具有抗病虫害能力，减少农药使 用
02 耐逆性
转基因植物对环境逆境有较强的适应能力
03 提高产量
转基因技术可以增加植物的产量，提高农作 物产量
转基因技术的争议
01、
安全性问题
转基因食品对人体安全性存在争议
部分人担心转基因食品可能引发健康问题
03、
02、
● 04
第四章 植物的基因编辑技术
基因编辑技术的 原理
基因编辑技术是一种 通过编辑植物基因组 中的特定位点，实现 精准基因改良的技术。 通过定点编辑，可以 准确调整植物的遗传 特性，进而培育出具 有目标性状的植物品 种。
基因编辑技术的应用
快速培育植 物品种
提高育种效率
增加植物抗 病能力
提高生存率
植物遗传改良是指通 过选择、杂交和变异 育种等手段改善植物 的遗传性状，以提高 产量、抗逆性等特性。 在农业生产中，植物 遗传改良起着关键作 用，帮助人类获取更 好的作物品种。
植物遗传改良的历史
农业起源时 期
人类最早开始进 行植物遗传改良
现代育种技 术
运用现代科学技 术加速植物遗传
改良进程
遗传学发展
精准改良遗 传特性
实现目标性状
基因编辑技术的前景
基因编辑技术为植物遗传改良带来了新的可能性， 有望进一步提高植物的遗传性状。随着技术的不 断发展，植物育种领域将迎来更多创新与突破。
基因编辑技术的挑战
01、
伦理挑战
涉及植物基因改良的道德问题
影响与利益的平衡
02、
法律限制
监管标准的制定与遵守
植物基因改良的法律法规
植物遗传改良对于实 现粮食安全、保护生 态环境等方面具有重 要意义。然而，也面 临着来自社会、伦理 和科技等多方面的挑 战。
优质实用课件推选植物遗传转化方法和技术
A、新霉素磷酸转移酶基因（Npt-II）
新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的， 其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和 G418。
对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有 效，对豆科和单子叶植物效果不佳。
B、庆大霉素抗性基因（gent）
该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因， 它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。
二、基因枪法（微弹轰击法）
1、工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或 钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射 入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入 细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从 而实现外源基因的转化。
步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了 受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当 广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效 方法之一。
A. 植物基因转化受体系统的条件
（1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 （6）具有经济价值或理论研究意义。
B. 植物基因转化受体系统的类型
1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含 目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，
转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
因此需要连续的再生系统
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
植物遗传转化(PPT-70)
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。
பைடு நூலகம்
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
植物遗传转化
从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验
，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因
植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种 。主要包括延熟番茄 , 抗除草剂的玉米、棉花 、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗 病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜 , 雄性不育的玉 米和莴苣 , 以及改变油脂特性的油菜和大豆等 。
。
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体 再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等 现象。
• 花粉管通道法 利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将 外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或 早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
转基因块茎中花色苷含量分析
一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法张兴国按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌ti质粒转化系统外植体农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养植株再生分子检测转基因植株获得技术特点
整合后外源基因结构变异小
操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核 酸分子引入受体细胞，外 源基因进入受体细胞核后 整合到染色体组，然后通 过组织培养再生出完整个 体(植株)。