蛋白质预处理

蛋白质预处理：

聚沉（coagulation）

是指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大聚沉物（＞1mm）的过程

絮凝（flocculation）

是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程

截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO)

是指不能通过膜的最小分子量

超滤

是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法

盐析

是指蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出。

透析

是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法

简述应用超滤法浓缩蛋白质样品的基本原理及该法的优点和局限性

答：基本原理：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超

滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果

优点：操作简便，不需添加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。在蛋白

质分子的制备技术中，超滤除用于浓缩外，还可用于蛋白样品的脱

盐和脱水

局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度

蛋白质样品的沉淀法有哪些优点和局限性？有哪几种常用的沉淀方法？选择沉淀方法时需要考虑哪些因素？

答优点：所需设备简单，操作方便；在蛋白质纯化的初期，可以减少样品体积，起到浓缩的作用，便于后续的纯化，降低纯化成本；还可

以尽快将目的蛋白与杂质分开提高目的蛋白的稳定性；通过该方

法，目的蛋白的回收率提高

局限性：由于沉淀法对提高蛋白质纯度的幅度比较有限，该法常只用于蛋

白质的初步纯化

常用方法：有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇沉淀法、选择性沉淀法选择沉淀方法时，需要考虑沉淀剂对目的蛋白质稳定性的影响，

沉淀剂的成本及操作的难易程度、沉淀剂的去除及残留、目的蛋

白的纯度要求及收率。

蛋白质样品的浓缩有哪几种方法？其各自的原理分别是什么？

答：沉淀：

在样品中加入适量的中性盐或有机溶剂等，使目标蛋白变成沉淀析出，再用合适的缓冲液溶解沉淀，达到浓缩蛋白质样品的目的。

超过滤：

选择适当孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果

透析：

是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，蛋白质分子体积大不能透过半透膜，从而达到浓缩蛋白质样品的目的。

吸附：

利用凝胶吸收水和小分子，当凝胶完全膨胀后，用过滤或离心方法除去凝胶，分离出蛋白质样品，适用于稳定性较差的蛋白质。

双水相分离法：

利用两种多聚物或多聚物与盐在水中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离纯化蛋白质，同时起到浓缩作用。

冷冻干燥：

在真空状态下，置于冻干机的冰冻抽提液可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不被破坏。

凝胶过滤层析：

凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）

又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography），它是以多孔性凝胶介质为固定相，根据不同蛋白的分子量大小差异，分离混合蛋白样品中各蛋白的液相色谱方法

排阻极限(exclusion limit)

指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量

分级范围(Fractionation range)

指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围

吸水量(Water regains)

是指1g干凝胶吸收水的体积或质量

床体积（Bed volume）

表示1g干凝胶在溶胀后所具有的最终体积

内水体积（Void volume）

表示层析柱中凝胶颗粒内部的空隙体积总和，常用Vo表示，用平均分子量为2000Da蓝色葡聚糖可测出

描述应用层析技术时一般如何检测装柱质量的好坏？

答：a、对光检查。对光肉眼观察装填平衡好的凝胶柱，柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡

b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱（如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋

白等），来观察洗脱过程中色带下降均匀与否，判断装柱质量。如果色带歪曲弥散，则需重新装柱

描述进行层析分离蛋白样品时采用手动加样法的具体操作？

答：填装好的凝胶柱经平衡后，用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液，待洗脱液下降至近床表面2-3mm时，关闭柱出口（注意不能使洗脱液全部流干）；用胶头滴管吸取一定体积的样品液后，贴柱内壁旋转缓缓加入，以防加样过快导致凝胶床面表面受损；加样完毕后，打开柱出口，让样品液缓慢渗入凝胶床内；当样品液面恰与凝胶床表面持平时，贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内壁，并使洗脱液高出凝胶床表面2-3cm，此后即可进行恒流洗脱。

凝胶过滤层析技术具有哪些特点？主要有哪些用途？

答：特点

（1）介质不带电荷，不溶于水，亲水性好；具化学惰性，不与被分离蛋白发生化学反应；分离条件温和，不会使蛋白变性失活

（2）分离效率高，回收率较高

（3）广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化，脱盐等

（4）一般采用细长柱

（5）经过凝胶过滤层析分离后样品将被稀释，因此上样前需对样品进行浓缩应用

1. 蛋白质样品的脱盐及缓冲液更换

2. 蛋白质样品的分级分离

3. 蛋白质分子量的测定

4．其他应用：变性蛋白质的复性研究、去除热原物质、分析蛋白质的结构。

对于已纯化的已知蛋白，通过凝胶过滤层析可分析其多聚体结

构。

良好的凝胶过滤层析介质应满足什么要求？常用的凝胶过滤层析介质的种类有哪些？试写出代表这些介质的英文名

答：良好的凝胶过滤层析介质应满足以下要求：

凝胶颗粒内部具有三维网孔结构：能使不同分子量的蛋白质得以分离

亲水性高，具有表面惰性：即介质与蛋白质之间不发生化学或物理相互作用稳定性强：在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿