毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体

一、毕赤酵母表达常用载体：

典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。

二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途

2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：

Trypton l％

Yeast Extract 0.5％

NaCl l％

PH 7.0

制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：

Trypton l％

Yeast Extract 0.5％

NaCl 0.5％

PH 7.0

制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周.

2.3 YPD （又称YEPD）

Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）

Trypton 2%

dextrose (glucose) 2%

+agar 2%

+Zeocin 100 µg/ml

液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。2.4 BMGY培养基

Yeast extract 1%

Peptone 2%

磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/L

YNB 1.34%

Biotin （4×10 -5 ）%

Glycerol 1%

毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。

2.5 BMMY培养基

Yeast extract 1%

Peptone 2%

磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/L

YNB 1.34%

Biotin （4×10 -5 ）%

methanol 3%

毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。

2.6YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：

yeast extract 1%

peptone 2%

dextrose (glucose) 2%

sorbitol 1 M

+agar 2%

+ Zeocin 100 µg/ml

不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.7 MGY

Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）

（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.8 MGYH

Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。

2.9 RD

Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）

（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）

1.将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；

2.冷却后于45℃水浴；

3.将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml 无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。

2.10 RDH

Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基+ 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。

2.11 RD及RDH平板的制备

1.将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；

2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml 的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；

3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。