生物制药工艺学 抗生素概述 讲义

第一节：抗生素概述教学目标：了解青霉素等抗生素的生产菌种、发酵工艺及操作要点和提取精制方法；掌握溶剂萃取法提取青霉素的原理。

教学基本内容：§1 概述1.1 β-内酰胺类抗生素结构和特性β-内酰胺类抗生素(β-lactam)包括青霉素(penicillins)、头孢菌素(cephalosporin)、头霉素(cephamycin)、克拉维酸(clavulanic acid)、塞纳霉素(thienamycin)以及单环β-内酰胺等。

这类抗生素都含有一个4员内酰胺环，并且通过N和相邻的碳原子和另一个杂环相稠合。

它们结构上的共同特点是：和内酰胺中Ｎ相邻的碳原子上有一个羧基；在内酰胺环中和Ｎ原子相对的Ｃ原子上有一个功能团胺基。

青霉素可看成是由β-内酰胺环、四氢噻唑环及酰基侧链构成；也可看成是由半胱氨酸、缬氨酸及侧链构成；而头孢菌素则是有由β-内酰胺环与六元的氢化噻嗪环骈合而成；或由半胱氨酸、缬氨酸、侧链和醋酸构成。

1.2 化学性质β-内酰胺类抗生素通常很活泼，它的化学性质大都和β-内酰胺环有关，由于为稠环系统，故环的应力增加，因而反应性更强。

在很多情况下，内酰胺环中羰基的反应性能和羧酸苷相似，很易被亲核试剂和亲电试剂作用，使内酰胺环打开而失去活性。

与青霉素相比，头孢菌素较不易发生开环反应，如醇能很快和青霉素的β－内酰胺环起作用，但头孢菌素较稳定，故可以把甲醇作为重结晶的溶剂。

头孢菌素对酸也较稳定。

§2 青霉素2.1 天然存在的青霉素青霉素的基本结构是由β-内酰胺环和噻唑烷环并联组成的Ｎ-６-氨基青霉烷酸。

当发酵培养基中不加侧链前体时，产生多种Ｎ-酰基取代的青霉素混合物，见上表，但其中只有青霉素Ｇ和青霉素Ｖ在临床上有用。

它们具有相同的抗菌谱（抗革兰氏阳性细菌），其中青霉素Ｇ对酸不稳定，只能非肠道给药吸收，而青霉素Ｖ对酸稳定，可以口服给药。

发酵中也产生青霉素母核6-氨基青霉烷酸（6-APA），但产量很低。

工业上是用固定化青霉素酰化酶水解青霉素Ｇ或Ｖ制备6-APA，再由化学法或酶法进行侧链缩合，获得一系列半合成青霉素。

2.2 青霉素的理化性质溶解度：青霉素G是一种游离酸，能与碱金属，碱土金属，有机胺等结合成盐。

青霉素本身容易溶于有机溶剂，如醇，酮，醚，酯。

在水中溶解度很小，但成盐后在水，甲醇中的溶解度大，而在脂性的有机溶剂中则不溶或难溶。

吸湿性：青霉素钠盐的吸湿性极强，铵盐次之，钾盐的吸湿性较小并更易保存。

青霉素的纯度越高，吸湿性反而减少，也就易于存放，所以晶体吸湿性小，而无定型粉末吸湿性就大。

稳定性：青霉素的水溶液很不稳定，一般都是固体保存，在临用前才用水溶解。

一般青霉素越纯，越干燥，稳定性越强。

青霉素成品中含有水分或纯度低，则稳定性大为降低。

酸碱性：青霉素分子中有一个羧基，故有酸性，因无碱性基团，不存在碱性。

青霉素的酸性在有机物中是较强的，但比无机酸弱，提取时，用酸将水溶液的pH调至2，就可以游离出青霉烷酸，而可用有机溶剂提取。

2.3 青霉素的主要化学反应青霉素是不稳定的化合物，在遇酸，碱或加热下易分解而失去活性。

青霉素的抗菌作用是以β-内酰胺环的完整性为基础的，而青霉素最易遭破坏的也是β-内酰胺环，所以，凡能使β-内酰胺环开裂的酸碱，酶，均可以使青霉素失去活性。

青霉素酶（β-内酰胺酶）能使β-内酰胺环开裂。

青霉素的裂解青霉素在青霉素酰胺酶的作用下，能裂解为6-氨基青霉烷酸。

该化合物既是青霉素的母核，又是半合成青霉素的原料。

反应式为：综上所述，青霉素在酶、碱、酸性存在下，不同的条件水解可以得到不同的产物。

绝大多数条件下都会使青霉素的β-内酰胺环开裂，使青霉素失去其抗菌活性。

只有用青霉素酰胺酶裂解，方可保住其抗菌活性。

2.4 青霉素的发酵工艺及过程2.4.1 菌株的改良与保存2.4.2 发酵工艺流程以丝状菌三级发酵工艺流程为例；此外还有球状菌二级发酵工艺流程。

其工艺流程基本相似。

2.4.3 发酵工艺过程及操作要点种子丝状菌的生产菌种一般保藏在沙土管内。

由沙土孢子接入母瓶斜面上，经25℃培养6~7天，长成绿色孢子，制成悬液，接入大米茄子瓶内。

经25℃相对湿度50%，培养6~7天，制成大米孢子，真空干燥保存备用。

生产时按接种量移入种子罐，25℃培养40~45小时，菌丝浓度达40%以上，菌丝形态正常，即移入繁殖罐内。

经25℃培养13~15h，菌丝体积占总体积40%以上，培养液中的残糖在1.0%左右，无菌检查合格便可作为种子，按30%的接种量移入发酵罐。

优质种子应该是：菌丝长稠，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，无杂菌。

要获得优质种子，就必须严格控制培养条件及培养原材料的质量。

培养基－－碳源碳源青霉菌能利用多种碳源，如乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，玉米油，豆油，天然油脂等。

乳糖能被产生菌缓慢的利用而成为维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但因货源少，价格高，普遍使用有困难。

天然油脂如玉米油、豆油也能被缓慢利用而作为有效的碳源，但不可能大规模使用。

目前生产上用的碳源是葡萄糖母液和工业用葡萄糖，最为经济合理。

培养基－－氮源氮源青霉素工业发酵中，利用的氮源有玉米浆，花生饼粉、麸皮粉、玉米胚芽粉及尿素等。

玉米浆是淀粉生产的副产物，含有多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸以及β-苯乙胺等，后者为苄青霉素生物合成提供侧链的前体。

但因为国内玉米浆产量少，经调整配方以花生饼粉代替，其生产水平可以达到用玉米浆的技术指标。

目前生产上用的氮源是花生饼粉、麸皮粉、玉米胚芽粉及尿素等。

培养基－前体青霉素发酵所用的前体有苯乙酸和苯乙酰胺等。

前体大部分会参与青霉素的生物合成，构成青霉素分子结构，也有一部分会被青霉素当成碳源和能源利用分解。

苯乙酸和苯乙酰胺在不同浓度和不同的酸碱度下，对青霉菌产生的毒性，以苯乙酰胺的毒性为大。

苯乙酰胺和苯乙酸浓度大于0.1%时，对青霉素的生长、繁殖和青霉素的生物合成均有毒性。

培养液的pH值不同，前体毒性也不同。

苯乙酸在pH5.5时，毒性较大，碱性条件下不抑制菌丝生长；苯乙酰胺毒性比苯乙酸毒性大。

前体在基础料中，一般加入0.07%的量，其余部分一般在补料中，同碳源、氮源一起加入，前体的浓度一般为0.1%。

近年来，也有利用苯乙酰酯类，醇类作为前体的，如用苯乙酸月桂酯，既可以作为前体，又能作为碳源被利用，还能作为消沫剂使用，用量为1.25~1.5%。

加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。

培养基－无机盐发酵液中，无机离子的种类和浓度对于青霉素菌的生长和生物合成均有影响：a. 硫的浓度降低时，青霉素的产量减少至30%；b. 磷的浓度降低时，青霉素的产量减少50%；c. 铁离子的浓度在6μg/mL时，对发酵无影响。

如果超过30－40μg/mL，对发酵产生不利的影响，且浓度越大，产量越低；d.钙、镁、钾等阳离子总浓度在300mmol/L为好，其中的比例为钾30%，钙20%，镁41%，此时青霉素的产量最高。

（3）培养条件的控制青霉菌细胞在生长发育过程中会发生明显的变化，按生长的特征分为6个时期：Ⅰ期分生孢子发芽孢子先膨胀，再形成小的芽管，原生质未分化，具有小空孢。

Ⅱ期菌丝繁殖原生质的嗜碱性很强，在Ⅱ期末有类脂肪小颗粒。

Ⅲ期形成脂肪包涵体积累贮藏物，没有空泡，原生质嗜碱性仍很强。

Ⅳ期脂肪包涵体形成小滴并减少形成中小空泡，原生质嗜碱性弱，并产生抗生素。

Ⅴ期形成大空泡其中含有一个或数个中性红染色的大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。

Ⅵ期菌丝完全自溶仅有空的细胞壁。

一般说来，I~Ⅳ期称初称菌丝生长期，年轻的菌丝，以菌丝生长、繁殖为主，不合成青霉素或合成青霉素较少；Ⅳ~Ⅴ期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势渐减弱，合成青霉素的能力最强。

Ⅵ期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。

在发酵过程中，要求尽量缩短菌丝的生长繁殖时间，延长青霉素的生物合成、分泌时间，通过工艺条件的控制，使最后一期尽量晚出现，提高青霉素的发酵单位和总产量。

加糖控制丝状菌的加糖依据是发酵液中残糖量和pH值。

一般残糖浓度降低至0.6%左右，pH上升后可开始补糖。

加糖率为0.07％~0.15%/h，每2h加1次。

球状菌加糖主要依据是pH，一般在20h当pH高于6.5时开始加糖，全程pH 要求6.7~7.0。

根据pH高低酌情减增，放罐要求pH低于7.0。

若改变加糖方式，以葡萄糖流加代替每2h的滴加，则可减少总的加糖量，还可提高发酵单位。

补料及添加前体丝状菌发酵于接种后8~12h，发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05％~0.08％。

若pH大于6.5可随时加入硫酸铵，使pH维持在6.2~6.4，发酵液氨氮控制在0.01~0.05％。

球状菌发酵因基础培养基内没有前体，所以从10h左右就开始加入尿素、氨水和苯乙酸的混合料，每3h加1次，由单位增长速率决定其加入量。

pH值的控制主要通过加葡萄糖控制pH，但加油多少对pH也有影响，当油量加入较多时要适当减少葡萄糖的量。

一般要求：丝状菌发酵pH6.2~6.4；球状菌发酵pH6.7~7.0。

如果超过7.0，容易产生水解反应，降低产量。

如果pH上升，可以加糖，油脂，硫酸，或硫酸铵等无机氮源；如果pH值下降，可加入碳酸钙，氢氧化钠，氨水或尿素，也可以增加通气量。

生产实践证明，用控制加糖量和加氮量的多少来调节pH比用加酸、碱直接调节pH的效果要好。

加糖、氮一方面可以调节pH，另一方面也可增加培养基的营养，促进青霉菌的生长；而直接用碱、酸来调节pH常常会调控过度，对青霉菌生长、青霉素合成不利。

温度的控制青霉菌的生长适宜温度约30℃，而分泌青霉素的温度是20℃左右，现在生产上均采用变温控制法，使之将发酵温度从26℃逐步降低至22℃，则可以延缓菌丝衰老，增加培养液中的溶氧浓度，延长发酵周期，有利于增加青霉素的合成和分泌，提高青霉素的产量。

一般丝状菌发酵的温度按照26℃→24℃→23℃→22℃控制；球状菌发酵则按照26℃→25℃→24℃控制为宜。

溶氧溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。

当溶氧浓度降低到饱和度的30%以下时，青霉素的产率急剧下降，低于10%，则造成青霉素发酵生产菌不可逆的损害。

溶氧浓度过高，说明菌体生长不良，对青霉素生产同样不利。

故在发酵过程中，要通入一定量的空气，并不断进行搅拌，保证发酵液的溶氧浓度。

一般通气比为1:1-0.8(体积/体积/分, V/V/min)左右。

搅拌的速度因发酵前期主要是菌体生长繁殖而应高些，发酵中后期降低转速不但能节约电能消耗，而且有利于青霉素的合成分泌，提高发酵单位。

发酵罐的搅拌速度一般以150-300r/min为宜。

泡沫的控制青霉素的发酵过程不断产生泡沫，为了使发酵顺利进行，应消除过多的泡沫。

以往多用豆油、玉米油等天然油脂消泡。